首页> 中文学位 >甲醛诱导下易误性跨损伤合成DNA聚合酶ζ及Rev1的表达改变
【6h】

甲醛诱导下易误性跨损伤合成DNA聚合酶ζ及Rev1的表达改变

代理获取

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章材料和方法

第三章 结果

第四章 讨论

参考文献

综述易误性跨损伤合成及其DNA聚合酶

英文缩略语词汇表

致谢

原创性声明

展开▼

摘要

本研究以甲醛为研究对象,通过MTT法确定甲醛对人支气管上皮细胞(16HBE)的剂量-反应关系,用彗星实验检测甲醛的遗传毒性,以实时荧光定量PCR法检测不同剂量毒物刺激下revl、rev3、rev7基因的表达改变,Westernblot方法检测Rev1、Rev3、Rev7蛋白的表达改变,从而探讨在不同剂量水平甲醛作用下,易误性跨损伤合成聚合酶ζ及相关因子Rev1的表达改变及其联系,为进一步研究跨损伤合成的分子机制提供理论依据。 研究材料和方法: 1.MTT法测定细胞增殖功能,确定实验分组采用噻唑蓝颜色反应法(MTT法)。作出甲醛诱导人支气管上皮细胞(16HBE)的剂量-反应关系曲线。参考文献资料以及预实验结果,确定各实验组甲醛染毒剂量。 2.流式细胞仪检测细胞周期按照确定的剂量对16HBE细胞进行染毒4小时后,终止染毒,收集细胞,用80%酒精固定过夜,送中山大学附属第一医院检验科用流式细胞仪检测细胞周期。 3.单细胞凝胶电泳检测DNA损伤培养16HBE细胞至对数生长期,甲醛染毒4小时,染毒结束后,去含甲醛的培养基,用PBS洗2遍,再加入完全培养基,将各组细胞置于15W紫外灯40cm下紫外线照射5分钟,同时设紫外线照射5分钟的对照组和阴性对照组,最后收集细胞,通过单细胞凝胶电泳检测不同剂量组细胞DNA损伤情况,测量彗星尾长,进行统计学分析,确定各剂量组甲醛对16HBE细胞的遗传毒性。 4.实时荧光定量PCR检测各组细胞rev1、rev3、rev7在mRNA水平的表达变化。 4.1:16HBE细胞总RNA的提取及cDNA第一链的合成培养16HBE细胞至对数生长期,甲醛染毒4小时,染毒结束后后,2.5mg/L胰蛋白酶消化收集各组细胞,用BBI公司的ClassicalTotalRNAIsolationKit进行总RNA的提取。取提取出的RNA4μ1溶液在1%琼脂糖凝胶中电泳鉴定所提取RNA的完整性,并用核酸定量仪测定纯度。RNA纯度符合RT-PCR要求的(A260nm/A280nm值在1.8-2.0范围内),用Fermentas公司的FirstStrandcDNASynthesisKit进行cDNA第一链的合成。将合成的cDNA置于-20℃保存。 4.2:实时荧光定量PCR检测rev1、rev3、rev7在mRNA水平的表达改变。 根据rev1、rev3、rev7基因的cDNA序列各设计一对引物,内参B-actin的引物参考文献合成。将上述制备的各组cDNA样品在MX4000荧光定量PCR仪上扩增,同时设置无模板对照,实验重复3次。所用的试剂盒为Stratagene公司的BrilliantSYBRGreenQPCRMasterMix。 4.3电泳鉴定PCR产物。 取6μlPCR产物上样在1.5%的琼脂糖凝胶上,在0.5×TBE缓冲液中,120V恒压电泳40min,鉴定PCR产物。 5.Westerblot检测各组细胞Rev1、Rev3、Rev7在蛋白质水平的表达改变培养16HBE细胞至对数生长期,甲醛染毒4小时后,终止染毒,提取总蛋白质,用BCA蛋白质定量测定试剂盒进行蛋白定量。进一步对各剂量组蛋白做SDS-PAGE电泳,以GADPH作为内参照。扫描图像输入电脑,ImageTool凝胶分析软件分析图像。 6.统计学分析用SPSS10.0软件对结果进行统计学分析,P<0.05为具有统计学意义。 研究结果: 1.MTT法检测结果: 1.1支气管上皮细胞16HBE在甲醛染毒下的剂量-反应关系当甲醛浓度低于0.01mmol/L时,细胞存活率变化无统计学意义;随甲醛浓度的升高,细胞存活率逐渐降低,当浓度达到0.5mmol/L以上时,细胞存活率的降低具有统计学意义(P<0.05);甲醛的半数抑制浓度(IC50)约1mmol/L。 1.2各试验组甲醛的确定根据MTT实验的结果,参考文献及其预实验的结果,确定实验分7个剂量组,各剂量组甲醛染毒浓度分别是0.001mmol/L、0.010mmol/L、0.025mmol/L、0.050mmol/L、0.100mmol/L、0.500mmol/L、1mmol/L,另设一个阴性对照组。 2.流式细胞仪检测细胞周期与空白对照比较,差别无统计学意义,提示细胞周期无明显改变,未出现细胞周期阻滞现象。 3.单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤甲醛染毒剂量在0.001mmol/L-0.01mmol/L之间,彗星尾长随着剂量的增加而增大;甲醛染毒剂量在0.01mmol/L-1mmol/L之间,彗星尾长随着剂量的增加而减小;当甲醛染毒剂量≥1mmol/L时,彗星尾长与空白对照组相比较差别已经没有统计学意义。 4.实时荧光定量PCR检测rev1、rev3、rev7基因在各组样品中的表达随着甲醛染毒剂量的增加,16HBE细胞中rev1、rev3、rev7的表达出现先增加后减少的趋势:甲醛浓度在0-0.5mmol/L时,上述基因的表达随着剂量增大而增加;当甲醛浓度大于0.5mmol/L时,上述基因的表达随甲醛剂量增大而减少。 5.Westernblot检测Rev1、Rev3、Rev7蛋白在各组样品中的表达将Westernblot结果胶片进行扫描,以ImageTool凝胶分析软件分析蛋白印迹灰度值发现,甲醛浓度在0-0.5mmol/L时,Rev1、Rev3、Rev7蛋白图像的灰度逐渐增加,甲醛浓度在0.5mmol/L时,Rev1、Rev3、Rev7蛋白图像的灰度开始降低。表明Rev1、Rev3、Rev7蛋白在各组样品中的表达改变与实时荧光定量PCR检测的mRNA表达改变具有一致性。 研究结论: 1.应用单细胞凝胶电泳检测DNA损伤表明,甲醛在不同剂量时导致不同类型的DNA损伤。结合文献报道,表明在低剂量时,甲醛引起的DNA损伤主要以DNA断裂为主;在较高剂量时,随着剂量增大,甲醛引起DNA交联的作用不断增加。本研究中发现,甲醛在低于0.01mmol/L时,引起的16HBE细胞DNA损伤可能主要以断裂为主;高于0.01mmol/L时,则以DNA交联为主。 2.实时荧光定量PCR检测基因表达结果表明,较低剂量甲醛染毒(≤0.01mmol/L)引起DNA断裂时,易误性跨损伤合成DNA聚合酶ζ的表达随着剂量增加而增加,提示DNA聚合酶ζ参与DNA断裂的跨损伤合成;当较高剂量甲醛染毒(>0.01mmol/L)引起DNA交联时,DNA聚合酶ζ表达出现先上升后下降,提示DNA聚合酶ζ可能在一定程度上也参与了DNA交联的跨损伤合成。Westernblot检测蛋白表达的结果也支持以上结论。 3.rev1与rev7、rev3的表达具有一致性,提示rev1、rev3、rev7在跨损伤合成过程中可能相互作用。同时,为DNA聚合酶ζ在易误性跨损伤合成中的Rev1依赖性,提供了一定的实验室依据。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号