肺炎支原体的感染、耐药情况及其对阿奇霉素耐药机制的研究

摘要

肺炎支原体(Mp)是儿童和青少年社区获得性呼吸道感染的常见病原体之一，支原体作为原核生物界中的最小微生物，结构中无细胞壁，因此对作用于细胞壁的抗生素如青霉素类、头孢类抗生素天然耐药，而对影响细菌蛋白质合成的抗生素如四环素类、大环内酯类、喹诺酮类等敏感。由于药物本身较大的不良反应以及儿童处于生长发育期等原因，四环素类、喹诺酮类药物的使用受到一定的限制，目前临床治疗应用最广泛的药物为大环内酯类，如阿奇霉素。 国内外检测Mp方法很多，目前主要包括经典的培养法、血清学抗体检测方法和核酸检测方法等，但尚无令人满意的、能准确、快速、经济而又简便的检测方法对Mp感染进行诊断。因此，寻求更加适合临床检测要求的诊断方法显得尤为重要。 本课题研究目的在于通过不同的检测方法，调查本院社区获得性呼吸道感染病人中Mp感染的情况，并且寻求更加适合临床检测要求的诊断方法，为肺炎支原体感染的临床诊断提供依据。通过分离培养临床的Mp菌株，了解本院Mp对抗生素耐药情况，并结合体外诱导耐药的研究，检测阿奇霉素对Mp作用靶位的基因突变情况，从而初步阐明Mp对阿奇霉素的耐药机制，为临床抗生素合理选择和应用提供理论指导，并对抗生素的改造和使用提供一定的理论依据。 对象和方法： 1、收集2007年8月至2008年3月本院呼吸科和儿科的住院、门诊社区获得性呼吸道感染病人(住院病人入院天数在2天以内)的咽拭子、痰标本，床边接种到肺炎支原体液体培养基中，置于37℃、5％CO2环境培养5天，由红变为黄并且澄清判定为阳性，再转入固体培养基培养进行鉴定。采用CCU法测定菌株浓度，微量肉汤稀释法进行体外药物敏感性测定，选用药物为红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、洛美沙星、氯霉素。 2、2007年3月至2008年2月一年中，从呼吸科、传染科、外科、儿科的住院和门诊的社区呼吸道感染病人(住院病人入院天数在2天以内)抽取的血清作为临床检测标本，应用Serodia-Myco Ⅱ试剂盒检测Mp-Ig M抗体，以单份血清抗体滴度≥1：320或者恢复期血清抗体升高4倍判定为肺炎支原体感染。对年龄和不同季节进行分组，采用卡方检验的方法，对各年龄段和不同季节阳性率进行统计学分析。 3、收集2007年8月至2008年3月本院呼吸科和儿科的住院、门诊社区获得性呼吸道感染病人(住院病人入院天数在2天以内)的咽拭子、痰标本，床边接种到肺炎支原体液体培养基中，置于37℃、5％CO2环境培养24h，进行PCR检测，临床标本继续培养4天，观察培养结果。对病人年龄进行分组，采用卡方检验的方法，对各年龄段阳性率进行统计学分析。 4、收集2007年8月至2008年3月本院儿科和呼吸科住院的社区获得性呼吸道感染患者(住院病人入院天数在2天以内)的痰或者咽拭子标本，采用培养法、培养-PCR法检测，并同时留取血清标本做Mp-IgM抗体的检测。采用卡方检验的方法，对三种不同方法检测Mp的阳性率进行统计学分析。 5、使用PCR技术将FH标准株、对阿奇霉素敏感株和耐药株Mp的23S rRNA V区基因、23S rRNA Ⅱ区基因、rplD基因、rplV基因序列扩增，测序，并与GenBank数据库提供的Mp M1 29相应基因作对比，检测耐药基因变异位点。 6、Mp体外诱导耐药分析和耐药机制研究：将药敏试验中红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、洛美沙星所测得的Mp标准株亚抑菌浓度作为体外诱导耐药的传代生长培养浓度，当Mp对阿奇霉素的MIC达到耐药水平时，检测23S rRNA V区基因、23S rRNA Ⅱ区基因、rplD基因、rplV基因有无突变位点。 结果： 1、Mp的临床分离、体外培养和药物敏感试验结果。 2007年8月至2008年3月呼吸科和儿科的门诊、住院的社区获得性呼吸道感染病人(住院病人入院时间在2天内)总共493例，年龄组成为6个月-79岁，取咽拭子、痰标本进行Mp培养，阳性者4例，阳性率为0.81％。通过对标准株和临床分离的4株Mp做药物敏感试验可知，标准株对红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、洛美沙星、氯霉素五种药物均敏感，4株临床分离株中，对红霉素和阿奇霉素耐药的有2株，它们都对红霉素高水平耐药(MIC>=32 ug/ml)，对环丙沙星和洛美沙星耐药的有3株，4株临床株对氯霉素都敏感。存在多重耐药情况，其中对两种药物耐药的有1株，对四种药物耐药有2株。 2、肺炎支原体血清抗体测定结果。 2007年3月至2008年2月，呼吸科、传染科、儿科的门诊和住院2天以内的社区获得性呼吸道感染病人共1335例，病人年龄分布于5天-94岁，阳性例数为36例，阳性率2.70％。0-20岁组阳性率(4.43％)高于41-60岁组(0.56％)、61岁组以上组(0.53％)阳性率(P<0.05)。21-40岁组阳性率(3.65％)高于41-60岁组(0.56％)和61岁组以上组(O．53％)阳性率(P<0.05)。对一年四季肺炎支原体血清抗体阳性率进行比较，结果显示各季节阳性率无统计学差异(P>0.05)。 3、培养-聚合酶链反应检测Mp的结果。 2007年8月至2008年3月我院呼吸科和儿科的住院、门诊的社区获得性呼吸道感染病人(住院病人入院时间在2天内)共493例，患者年龄组成为6个月-79岁，检测阳性者10例，阳性率2.03％。比较0-40岁(2.45％)和41-80岁(1.20％)阳性率，统计学分析显示二者之间无统计学差异(P>0.05)。 4、三种不同方法检测Mp的比较结果。 2007年8月至2008年3月我院呼吸科和儿科的社区获得性呼吸道感染住院病人(入院时间在2天内)共148例，使用肺炎支原体血清抗体检法检测阳性率11.49％，培养-PCR法阳性率6.76％。培养法阳性的共4例，阳性率2.70％。经统计学检验，培养法与抗体法阳性率、培养-PCR法与培养法阳性率有统计学差异(P<0.05)，培养-PCR法与抗体法阳性率无统计学差异(P>0.05)。 5、对阿奇霉素耐药基因变异位点分析结果。 与标准株M129株相比，对阿奇霉素耐药的分离株2的23S rRNA的V区基因的2063位发生A到G的点突变，rplD基因出现162位C到A、430位A到G的点突变， rplV基因出现279位T到C、508位T到C的点突变。对阿奇霉素耐药的分离株3的rplV基因出现508位T到C的点突变，23S rRNA的V区基因、rplD基因未出现点突变。对阿奇霉素敏感的分离株1和4的23S rRNAv区基因、rplD基因、rplV基因均未出现点突变。FH标准株与分离株2的rplD基因均出现162位C到A、430位A到G的点突变， rplV基因也都出现279位T到C、508位T到C的点突变，但23S rRNA的V区基因无点突变。所有菌株的23S rRNA Ⅱ区均未出现点突变。 6、Mp标准株(FH株)体外诱导耐药及其药敏分析结果。 使用红霉素对Mp标准株进行体外耐药诱导，第20代MIC值为0.64 ug/ml，使用阿奇霉素对Mp标准株进行体外耐药诱导，第20代MIC值为0.0512ug/ml，检测rplD基因、rplV基因、23S rRNA Ⅱ区基因、23S rRNA V区基因位点，均未出现点突变。 结论： 1、我院存在肺炎支原体对大环内酯类和喹诺酮类抗生素耐药的菌株，并且有多重耐药的现象。 2、使用血清抗体法对1335例社区获得性呼吸道感染病人进行检测，肺炎支原体感染率为2.70％，青少年和儿童感染率高于其他年龄段。我院各季节的阳性率无统计学差异，提示各季节的发病呈散发，无明显爆发现象。 3、使用培养-PCR法对493例社区获得性呼吸道感染病人进行检测，肺炎支原体感染率为2.03％，0-40岁和41岁-80岁组阳性率无统计学差异。 4、血清抗体法和培养-PCR法并用检测肺炎支原体感染优于单一检测的方法。 5、 Mp对阿奇霉素耐药的机制可能与23S rRNA V区基因的点突变相关，与23SrRNA Ⅱ区基因、rplD基因、rplV基因是否相关尚不能肯定。 6、Mp体外诱导耐药的实验中，红霉素和阿奇霉素的MIC值有升高的趋势，但尚在敏感范围内，23S rRNA V区基因、23S rRNA Ⅱ区基因、rplD基因、rplV基因未发生点突变，尚不能由此阐明Mp对阿奇霉素的耐药机制。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引 言

第二章材料与方法

第三章结 果

第四章讨 论

第五章结 论

第六章展 望

参考文献

附录

致 谢