汕头湾表层沉积物中微生物多样性和几丁质酶产生菌的研究

摘要

本研究以其汕头湾表层沉积物中的微生物为研究对象,以16S rDNA和几丁质酶保守基因片段为切入点,对沉积物中微生物种的种群多样性进行了较系统的研究;并在沉积物中分离了多株几丁质酶产生菌,对其几丁质酶编码基因和产几丁质酶条件进行了探索性的研究。
　　采用PCR-DGGE技术和16S rDNA文库方法在汕头湾表层沉积物的宏基因组中获得97条16S rDNA序列,分别归属于10个细菌类群:变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、脱铁杆菌门、螺旋体门、绿弯菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门、异常球菌-栖热菌门和浮霉菌门。其序列信息与NCBI收录的序列相似率分布在81％~100%之间,以97%为分界点,大于97%的有47个克隆子,占48.5%,小于或等于97%的共有50个克隆子,占到51.5%,其中有4个克隆子因为相似率太低,尚不能确定其分类地位,说明汕头湾表层沉积物中蕴含有丰富的微生物资源,并且,大部分的微生物是目前还没有被发现和研究的新种。
　　采用PCR方法在沉积物扩增得到63条几丁质酶编码基因片段,其编码的蛋白序列与NCBI收录的序列的相似率分布在41%~97%之间,且大多数在70%以下,只有8个克隆子的相似率在70%以上,NCBI数据库中与其相似性最高的几丁质酶蛋白序列有18条,其中与橙色滑柱菌株(Herpetosiphon aurantiacus) ATCC23779的几丁质酶存在着最高相似性的序列有27条,另外,还包括一些未可培养细菌的几丁质酶,说明汕头湾表层沉积物中存在着多样性程度非常高的几丁质酶编码基因,并且,其中有很多是目前尚未研究的。
　　另外,在沉积物中分离得到产几丁质酶菌株69株,根据16S rDNA序列确定了SWCH-1、SWCH-2、SWCH-3、SWCH-5、SWCH-6和SWCH-9六株几丁质酶活力较高的菌株的属,分别为:短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas);对着六株菌的几丁质酶编码基因片段进行扩增,显示其均含有18家族的几丁质酶编码基因,但其编码的蛋白序列与NCBI收录的序列存在着差异,其中SWCH-1和SWCH-3的序列的差异比较大;根据菌株SWCH-6的形态特征、生理生化特征进一步鉴定其为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophlilla)。采用单因素优化方法结合正交实验,得到菌株SWCH-6产几丁质酶的最佳发酵条件:胶体几丁质25.0g/L,胰蛋白胨10.0g/L,陈海水1.0L,pH8.5,32℃,150rpm培养72h;在该条件下酶活力达0.39U/ml。此外,菌株所产几丁质酶的最适催化pH值为5.0;最适催化温度为40℃;Cu2+、Fe3+及表面活性剂Tween-80能增强该酶的催化活性;Zn2+、Mn2+及表面活性剂SDS、洗衣粉对该酶的催化活性有抑制作用,与其它几丁质酶存在着一些不同;另外,实验发现SWCH-6有一段90kDa左右的胞外几丁质酶蛋白,但其编码基因尚未克隆到,还发现一段60kDa左右的胞内差异蛋白,是否与几丁质降解有关尚需进一步的实验。

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第一章 引言

1 几丁质降解菌与几丁质酶

1.1 几丁质

1.2 几丁质降解菌

1.3 几丁质酶

1.4 几丁质酶编码基因

2 宏基因组和DGGE技术在微生物多样性研究中的应用

3 本论文的主要研究内容和意义

第二章 汕头湾表层沉积物中微生物多样性研究

1 材料与方法

1.1 样品采集

1.2 试剂

1.3 方法

2 结果与分析

2.1 汕头海域表层沉积物中微生物宏基因组的提取

2.2宏基因组中16S rDNA片段的扩增

2.3 16S rDNA V3-V5区的扩增

2.4 DGGE电泳检测和条带分析

2.5 16S rDNA文库克隆子序列分析

2.6 几丁质酶基因保守区的扩增

2.7 DGGE电泳检测

2.8 几丁质酶基因文库克隆子序列分析

3 讨论

第三章 几丁质酶产生菌的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 试剂

1.3 方法

2 结果与分析

2.1 几丁质降解菌的筛选与六株几丁质降解菌的鉴定

2.2 六株菌几丁质酶基因片段的扩增和序列分析

2.3 菌株SWCH-6的进一步生理生化特性的鉴定

2.4 菌株SWCH-6几丁质酶发酵条件优化

2.5 菌株SWCH-6的几丁质酶性质

2.6 菌株SWCH-6几丁质酶蛋白的研究

3 讨论

总结与展望

参考文献

附录

科研情况

致谢