原发和复发骨巨细胞瘤差异表达基因的鉴定及其生物信息学分析

摘要

骨巨细胞瘤（Giant Cell Tumor of Bone，GCTB）是一种相对少见的肿瘤，虽为良性，但具有极强的侵袭性，主要表现为长骨干骺端的大范围骨质破坏、明显的复发倾向和少数肺转移。手术治疗是其主要治疗手段，手术方式主要包括病灶刮除术与瘤段切除术。据以往研究报道，GCTB手术后局部复发率高达20％～50%，同时，约有10%GCTB会发生恶性转化，1%~4%会发生肺转移。因GCTB组织来源尚不明确,生物学行为复杂多变，预后不容易准确判断，是当今临床骨科肿瘤性疾病诊疗中的难题。
　　以往依据巨细胞的数量和肿瘤基质细胞组织学特征，对GCTB进行Jaffe病理分级。但经长期临床观察发现，Jaffe病理分级标准与GCTB生物学行为以及患者的预后不甚相符。有些Jaffe病理分级为Ⅰ级，却发生早期肺转移或复发。而基于X线检查的Campanicci’s分级，以及将临床症状、X线检查和病理变化三者结合在一起的Ennecking分级，虽然对GCTB具有一定的参考价值，但与Jaffe病理分级一样，均不能完全准确反映其恶性程度、转移和复发的倾向。因此，研究开发新的GCTB分子标志物，对正确评估GCTB的生物学行为，促进GCTB诊治效果有重要临床意义。
　　近几年,随着高通量技术的发展，通过基因芯片技术探讨GCTB发生分子机制，并力图在分子水平上建立GCTB分级方法逐渐受到重视。以往有关骨巨细胞瘤的相关研究主要集中在研究者感兴趣的个别基因上。由于GCTB的形成是多基因、多因素相互作用的结果，对个别基因的研究并不能够充分揭示GCTB发病与复发的复杂机制。基于此，本课题将筛选大量骨巨细胞瘤复发差异表达基因，联合生物信息学手段进行研究，以期在分子水平深刻揭示GCTB复发分子机制。
　　本文选取12例原发GCTB和12例复发GCTB组织，应用Affymetrix公司最新推出的QuantiGene技术，对上述GCTB样本进行多基因定量检测分析。采用Fold change方法，计算复发组与原发组样本基因的表达差异，结果总共获得显著差异表达基因32个，其中上调20个，下调12个。在此基础上，进一步应用iSubpathwayMiner软件，首先对这些差异表达基因进行细胞信号通路富集分析，获得了6个完整的信号通路，包括Focal adhesion和Cell adhesion molecules；随后，对这些差异表达基因进行细胞信号子通路富集分析，获得了11个子通路，新增的有Pathway in cancer，p53 signaling pathway，MAPK signaling pathway等多个与肿瘤密切相关的信号通路。通过对子通路进行分析还发现，与骨巨细胞瘤复发相关的差异表达基因位于细胞信号通路局部区域的关键位置:1）IGF1位于Pathway in cancer的起始区域；2）MDM2定位于p53 signaling pathway子通路path:04115_1的中央区域；3）MYC，JUN和RAC1分布于Wnt信号通路子通路path:04310_2的终点；4）JUN，NFKB1，STAT1和RAC1位于破骨细胞分化通路（osteoclast differentiation pathway）。
　　为了探讨关键蛋白最大可能的生物学效应，我们构建了骨巨细胞瘤复发差异表达基因的PPI子网络，并综合运用GO注解、亚细胞定位、网络模块等技术，对差异表达基因PPI网络的潜在生物学功能、蛋白定位层次和功能模块进行分析评估。结果显示：1）该 PPI网络含1893节点，28713边；2）该PPI网络拓扑结构特征显示度的分布服从幂律曲线，R2为0.838，说明该网络具有无尺度特点，为真实复杂生物网络；3）网络GO富集分析获得了432个GO富集注释，从中发现了许多以往与骨巨细胞瘤相关的通路；4）亚细胞定位显示蛋白节点分布包括了从胞外-膜-细胞骨架-胞浆-核内等广泛空间，形成数量巨大的类似pathway的蛋白级联关系；5）PPI网络模块分析，从中发现了多个紧密联系的模块。
　　通过在50例骨巨细胞瘤病例的石蜡标本中对四个重要基因（MDM2、IGF1、STAT1和RAC1）的免疫组化和多因素logistic回归分析，结果显示：1）这四个标志物的免疫组化染色具有相对一致的趋势，即标本对其中一个标志物阳性，对另外三个标志物大多数情况下也呈阳性表达；2）这四个基因的高表达与骨巨细胞瘤的复发显著相关；3）这四个基因是骨巨细胞瘤复发的危险因素,可以作为 GCTB预后分子标志物，并有希望成为治疗靶标。
　　综上所述，本研究利用基因芯片技术，筛选出32个GCTB复发差异表达基因；进一步采用生物信息学手段，获得了与疾病相关的6个完整细胞信号通路及11个子通路；构建并分析了差异表达基因的 PPI网络；同时初步证实了 MDM2、IGF1、STAT1和RAC1是GCTB复发的分子标志物。

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第一章 绪 论

1.1 背景

1.2 骨巨细胞瘤的临床特征、治疗及复发

1.3 骨巨细胞瘤病理特点以及复发相关基因研究进展

1.4 本课题的研究意义

1.5 本课题的研究内容

第二章 骨巨细胞瘤复发差异表达基因的筛选

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 骨巨细胞瘤复发差异表达基因的生物信息学分析

3.1 生物信息学分析对于提示差异表达基因功能的重要性

3.2 KEGG通路的意义和重要性

3.3 子通路（subpathway）分析的意义

3.4 通路分析方法

3.5 结果

3.6 讨论

第四章 骨巨细胞瘤复发差异表达基因免疫组化验证

4.1 引言

4.2材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

第五章 骨巨细胞瘤复发差异表达基因PPI网络分析

5.1差异表达基因PPI网络的构建

5.2 PPI网络拓扑结构特征分析

5.3 差异表达基因PPI网络的亚细胞分层

5.4 PPI网络的功能注释

5.5网络模块的分析

5.6结果

5.7 讨论

论文总结

参考文献

附录 差异表达基因PPI网络基因的“biological process”功能富集

个人简历

致谢