丹参多糖抗小鼠免疫性肝损伤及其免疫调节机制的研究

摘要

研究背景:
　　 我国肝病的主要发病因为是感染肝炎病毒。流行病学资料表明,我国每年有50万～100万新发病例,而且在全球约3.5亿以上慢性乙型肝炎病毒携带者中,中国人占80％。在HBV感染者中,有10％～15％的患者可发展为慢性HBV感染,从慢性肝炎发展为纤维化一般只需2～6年时,其中25％～40％的病例最终发展为肝硬化乃至肝癌。研究肝炎的发生机理及寻找有效的治疗措施是国内外学者共同研究的热门课题,大量研究表明,免疫功能的异常改变和氧自由基的大量产生是引起肝组织损伤的重要因为。
　　 本课题组在进行药物成分分离的实验中提取到了丹参中的多糖成分,经文献检索发现丹参中作为重要有效部位的多糖成分研究较少。现有文献报道的丹参多糖提取方法为水提醇沉法,其提取方法的缺点是操作复杂、多糖提取率较低,而且关于丹参多糖药效和药理方面的研究更少。本课题组进一步将丹参多糖的提取工艺进行优化,找到一种多糖提取率高、成本低廉、操作简单的提取方法。鉴于大多数多糖的疗效及丹参的临床应用,我们将对丹参多糖对免疫性肝损伤的影响及免疫调节机制进行初步研究,从而为其进一步研究开发奠定理论和实验基础。
　　 研究目的:
　　 通过对丹参多糖提取工艺、丹参多糖抗免疫性肝损伤及其免疫调节机制的实验研究,提供一种从丹参中提取多糖的方法并阐明其抗免疫性肝损伤及免疫调的作用机制,为丹参多糖的进一步开发利用奠定实验基础。
　　 研究方法:
　　 1.丹参多糖的提取
　　 1.1粉碎:将丹参粉碎至粒径为70～90μm的微粉。
　　 1.2脱脂:将丹参微粉用10倍体积的浓度大于或等于85％乙醇回流2小时,过滤,取滤渣挥干溶剂后备用。
　　 1.3酶处理:将脱脂处理后的丹参微粉加到水中,再加入酶,然后用碱将pH值调节至5.5,在70℃下保温1小时:所述的酶可以是纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的一种,用量为丹参重量1.5％,也可以纤维素酶、木瓜蛋白酶、果胶酶中的两种以上,每种酶的用量为丹参重量1％,最好是纤维素酶和木瓜蛋白酶,每种酶的用量均为丹参重量的1.5％。
　　 1.4超声提取:在频率为59kHz的超声波下处理,过滤,收集滤液,滤液浓缩至1:2(每2ml药液相当于1克药材)。
　　 1.5醇沉:加入70ml的乙醇使其在滤液中的浓度至85％,滤去乙醇即得丹参多糖粗品,再经洗涤得丹参多糖,75℃真空干燥。
　　 2.丹参多糖抗卡介苗(BCG)加脂多糖(LPS)诱导的小鼠免疫性肝损伤的实验研究
　　 2.1实验分组
　　 昆明小鼠,SPF级,体质量18～22g,60只(南方医科大学实验动物中心提供)。采用随机分组的方法分为正常组、模型组、丹参多糖高(360mg/kg)、中(180mg/kg)、低(90mg/kg)剂量组、联苯双酯组(200mg/kg),每组10只,雌雄各半。除正常组小鼠外,其余小鼠在造模的同时灌胃给药,灌胃剂量为0.5ml/20g,正常组小鼠给同等剂量生理盐水。
　　 2.2造模方法
　　 采用BCG加LPS诱导小鼠免疫性肝损伤。小鼠尾静脉注射BCG浆液0.2 ml/只(含菌量5×107单位),致敏后12 d,尾静脉注射LPS 0.2 ml/只(7.5μg)以诱导肝损伤,正常组小鼠尾静脉注射同等剂量生理盐水。
　　 2.3指标检测
　　 2.3.1摘眼球采血后,离心获取血清,按试剂盒说明操作检测血清ALT、AST、NO活性。
　　 2.3.2小鼠处死后,立即取出所需肝脏,称取0.25g肝组织用冷生理盐水洗去浮血,配成10％肝组织匀浆,匀浆液经500转离心20min去胞核碎片后,再经3000转离心15min,取上清液,ELISA方法检测TNF-a、IL-1β含量。
　　 2.3.3肝组织固定、切片和肝组织病变程度分级方法
　　 处死动物,取出肝脏,用冷生理盐水洗去浮血,拭干。于肝门处及右肝叶取材4块,每块大小约为1.5cm×1.5cm×0.4cm,立即用10％中性福尔马林固定。70％、80％、90％、95％、100％乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片机作4μm切片,常规脱蜡,HE染色,中性树胶封片。用显微镜观察,以及PM-20型显微摄像系统照相。
　　 光镜下检查,按肝脏坏死程度分级:“-”,未见明显病理改变；“+”,部分肝组织肿胀伴有散在的点状坏死,汇管区有少许炎性细胞浸润；“++”,肝细胞肿胀有点状坏死及小灶性坏死,可见散在的肉芽肿形成,汇管区有大量炎性细胞浸润:“+++”,肝细胞肿胀,有大片状坏死,有肉芽肿形成,汇管区及周围有大量炎性细胞浸润。
　　 3.丹参多糖对免疫功能调节的机制研究
　　 3.1 BALB/e小鼠,SPF级,中山大学实验动物中心提供。分离BALB/c鼠脾细胞,不同浓度(1、10、50、100、200mg/l)丹参多糖对淋巴细胞(浓度1×106 cell/ml)作用48h,MTT法检测细胞增殖。
　　 3.2分离B、T淋巴细胞,不同浓度(1、10、50、100、200mg/l)丹参多糖分别对B、T淋巴细胞(浓度1×106 cell/ml)作用48h并与分裂素ConA(T细胞)、LPS(B细胞)(最终浓度5μg/ml)作比较,MTT法检测细胞增殖。
　　 3.3不同浓度(1、10、50、100、200mg/l)丹参多糖作用于T淋巴细胞72h,流式技术分析CD4+、CD8+的变化。
　　 3.4200mg/l浓度丹参多糖作用于T细胞不同时间(12、24、48、72h),ELISA分析IL-2、IL-4浓度。
　　 3.5200mg/l浓度丹参多糖作用于T细胞不同时间(24、48、72h),荧光定量PCR分析IL-2、IL-4水平变化。
　　 4.统计处理
　　 实验结果用均数((x))±标准差(s)表示,组间比较用one-way ANOVA。方差齐性时,采用LSD方法进行组间多重比较；方差不齐时,采用Welch法,组间多重比较采用DunnettT3方法进行。两组等级资料的比较采用两个独立样本的非参数检验Mann-WhitneyU法,多组等级资料的比较采用多个独立样本的非参数检验KrusKal-WallisH法,用统计软件SPSS13.0进行分析,以P<0.05定为差异有统计学意义。
　　 结论:
　　 1.确定最优丹参多糖提取工艺条件为:以加水为12倍药材重量,粒度为过20目筛,超声提取时间20min为最佳提取条件,本提取方法具有低耗能、提取率高、操作简单等优点。
　　 2.结果显示丹参多糖有抗免疫性肝损伤的作用,这种作用的实现不仅表现在直接的保肝降酶方面,还对肝损伤后小鼠的免疫功能起到调节作用,通过免疫功能的调控进一步发挥保肝降酶作用。
　　 3.体外实验说明丹参多糖在一定浓度范围内对淋巴细胞有较强的增殖作用,并且还有促进相关细胞因子表达及分泌的作用,与体内试验的结果相一致,进一步说明丹参多糖在免疫调节方面有很好的疗效。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 前言

第一章 丹参的研究进展

1.丹参简介

2.丹参的化学成分研究

3.丹参的药理作用

4.参考文献

第二章 多糖的研究进展

1.多糖的简介

2.多糖的主要生物学活性

3.多糖的研究展望

4.参考文献

第三章 实验技术路线图

第二部分 丹参多糖提取工艺研究

1.材料与仪器

2.方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

第三部分 丹参多糖抗免疫性肝损伤的研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.参考文献

第四部分 丹参多糖免疫调节机制的研究

1.材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

全文总结

缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

研究生毕业论文统计学审稿证明