混合附载内皮细胞与成骨细胞的纳米晶重组类人胶原基/聚乳酸修复骨坏死的实验研究

摘要

骨坏死是难治性疾病,尤其是股骨头坏死,其最终的结局是破坏髋关节结构。尽管有各种各样的保留骨关节的治疗股骨头坏死的方法,包括髓心减压、坏死病灶清除、骨髓基质干细胞移植、自体骨或异体骨移植、人工骨植入、血管植入及带血管骨组织移植等,但许多患者最终免不了需要人工关节置换。骨坏死区的根本问题是血管缺乏和骨组织坏死,骨坏死治疗的终极目标是骨组织的有效修复,血管生成是骨组织修复的前提。由于内皮祖细胞分化而来的内皮细胞参与了对成骨细胞的分化、增殖及代谢等生物作用,成骨细胞也调节内皮细胞的生物学行为,因而,在骨坏死区同时植入成骨细胞与内皮细胞,不仅可能促进骨坏死区新生血管网络形成,而且可能大大增强骨形成能力,提高骨修复效率。清华大学材料科学与工程系生物材料研究室研制了纳米晶类人胶原基骨修复材料,该材料是根据仿生的思路,将自组装过程中矿化的胶原与聚合物结合得到良好的细胞和生长因子载体材料。该材料具有天然骨的分级结构和成分,在纳米尺度上具有自体骨中的胶原/纳米磷酸钙的周期性层状结构。与天然动物胶原相比,基因重组胶原不仅有动物胶原蛋白的生物特性,如生物相容性、生物降解性、生物吸收性和生物粘附性,而且有可加工性、无病毒隐患及低排异反应等特点。
　　 本课题利用犬自体骨髓来源的基质干细胞在体外定向诱导分化为成骨细胞和内皮细胞,将其混合附载于纳米晶重组类人胶原基/聚乳酸(nano-hydroxyapatite/recombinant human-like collagen/polylactic acid,nHA/RHLC/PLA)复合材料后植入股骨头坏死区,有望促进骨坏死区血管生成,增强骨形成和骨修复的效果,为改善骨坏死区血液供应提供新的治疗手段,从而为骨坏死和骨不连等其它缺血性骨缺损疾病的预防与治疗提供借鉴。联合附载成骨细胞和内皮细胞也可能是使组织工程骨血管化及其与宿主骨组织有机整合的有效途径。本研究从四个方面进行了相关问题探讨。
　　 1.纳米晶重组类人胶原基支架材料的表征及体外生物相容性研究
　　 目的：探讨纳米羟基磷灰石/重组类人胶原基/聚乳酸复合支架(nano-hydroxyapatite/recombinant human-like collagen/polylactic acid,nHA/RHLC/PLA)对骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖、黏附及分化等生物学行为的影响。
　　 方法：制备nHA/RHLc/PLA复合支架材料,通过扫描电镜检查等方法观察材料的表征；将犬骨髓基质细胞(BMSCs)接种在支架材料上培养,检测材料一细胞的黏附情况及材料对细胞生长增殖的影响。
　　 结果：扫描电镜结果显示:支架材料呈三维多孔结构,孔为不规则多边形,孔的走向多样,纵向和横向孔隙互为交通,孔径在几十微米到300微米不等,孔隙率为75～83％。nHA/RHLC/PLA复合支架材料表面BMSCs的黏附、生长良好；而BMSCs的增殖能力与对照组相比,差异无显著性意义(P>0.05)。
　　 结论：nHA/RHLC/PLA复合支架材料具有良好的微观结构,无细胞毒性,细胞与支架生物相容性良好。利用重组类人胶原代替动物源性胶原制备纳米晶骨修复材料,规避了动物胶原交叉感染的风险,有望成为一种理想的骨组织工程支架材料。
　　 2.犬骨髓基质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究
　　 目的：采用血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)定向诱导犬第二代骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs),探讨BMSCs向血管内皮细胞(Vascular endothelialeells,VEC)分化的潜能和内皮细胞的特征性鉴定方法。
　　 方法：无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～20ml,全骨髓10％FBSDMEM培养液进行原代培养。将第二代纯化的BMSCs细胞悬液接种于培养瓶(皿)中,加入含VEGF、bFGF的DMEM/FI2培养液(使细胞密度为1×105 cells/ml),体外扩增培养、传代并进行鉴定。对细胞形态特征和特异性蛋白CD31、VEGFR-2、VWF的表达进行观察和检测。
　　 结果：原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长。诱导分化后的细胞光镜下单层融合生长,呈铺路石样形态；电镜下细胞呈多边形,可见特征性的Weibel-Palade小体；经成血管内皮细胞诱导培养7-14天后,BMSCs细胞CD31、vWF和VEGFR-2的表达呈阳性。
　　 结论：犬BMSCs易于体外分离培养及扩增；经VEGF、bFGF体外定向诱导后的细胞具有血管内皮细胞的特征且细胞纯度高、细胞数量大。
　　 3.犬骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究
　　 目的：采用地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C三种物质作为诱导骨髓间充质干细胞向成骨分化的基本辅剂,定向诱导犬第二代骨髓基质干细胞(bone marrowstromal stem cells,BMSCs),探讨BMSCs向成骨细胞分化的潜能和成骨细胞的特征性鉴定方法。
　　 方法：无菌条件下行犬髂骨穿刺,采集骨髓15～20ml,全骨髓10％FBSDMEM培养液进行原代培养。将第二代纯化的BMSCs细胞悬液接种于培养瓶或培养皿中,加入含地塞米松,β-磷酸甘油和维生素C的DMEM/FI2培养液(使细胞密度为1×105 cells/ml),体外扩增培养、传代并进行鉴定。对细胞形态特征进行观察:行碱性磷酸酶(ALP)染色,骨钙素(BGP)以及Ⅰ型胶原(ColⅠ)相关蛋白免疫荧光化学检测鉴定细胞性质。
　　 结果：原代培养的BMSCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长。诱导分化后的细胞形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大；BMSCs成骨诱导增殖电镜下细胞呈多边形,碱性磷酸酶(ALP)染色阳性；经成骨细胞诱导培养14d后,细胞BGP和ColⅠ相关蛋白表达阳性。
　　 结论：BMSCs易于体外分离培养及扩增,地塞米松、β-磷酸甘油和维生素C体外定向诱导能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。
　　 4.混合附载内皮细胞与成骨细胞的nHA/RHLC/PLA复合支架材料修复犬股骨头坏死的实验研究
　　 目的：探讨以nHA/RHLC/PLA复合支架材料为载体混合附载BMSCs来源的内皮细胞与成骨细胞修复犬股骨头坏死的可行性。
　　 方法：BMSCs向内皮细胞、成骨细胞诱导分化14天后,消化、收集细胞,调整细胞密度分别为1.0×104/ml,与nHA/RHLc/PLA支架材料共培养2～4小时,制成支架-细胞复合体。选取6～8月龄杂种犬18只36后肢股骨头造模,根据骨缺损处植入物不同分为3组各12肢:A组(支架-ECs+0Bs)、B组(支架-0Bs)、C组(单纯支架)。术后12W、24 W取材,行大体及组织学、免疫组化、形态学计量评价骨修复效果。
　　 结果：A组3个月时见缺损区基底部有大量的类骨质和新生骨小梁形成,在骨小梁的边缘存在较多的成骨细胞,骨小梁内可见骨细胞和破骨细胞,骨小梁间可见髓腔形成,修复区血管丰富。新生骨之间可见未完全降解的支架材料残留。成骨反应由基底向中心部推进。缺损中央区可见散在的碎裂的支架材料,细胞数量少。6个月时充填区骨小梁成熟明显,可见有编织骨形成。缺损区中央偶见碎裂的支架材料,其内见有大小不一的岛状新生骨,部分标本缺损区中央内部有肉芽组织形成,见大量梭形纤维样细胞,间充质细胞大量增生,有明显的成骨反应。新骨形成量和成骨细胞数由基底部向外周递减,骨小梁的成熟度也由基底向外周递减。B组3个月时缺损区基底部也可见明显成骨反应、类骨质形成,但骨小梁数目及成骨细胞、毛细血管均较A组少,纤维组织多。中央区见散在较大区域的未完全降解的支架材料残留。C组仅在缺损基底边缘可见少量新生骨组织,骨小梁数量少,骨小梁带窄；较多肉芽组织形成,见较多炎性细胞。亦可见成骨细胞和骨细胞。缺损区中央绝大部分为碎裂的不成形的支架材料残留,见少量间充质细胞,有较多炎性细胞,未见类骨质和髓腔形成。A组3个月和6个月时缺损区类骨质和新生骨小梁,以及残留支架材料内的新生微血管数量均较B组(OBs+支架)和C组(单纯支架)丰富。
　　 结论：骨髓基质干细胞来源的成骨细胞具有修复股骨头骨坏死的能力;内皮细胞和成骨细胞联合应用的成骨能力及血管化程度优于成骨细胞的单独修复,内皮细胞可以增强成骨细胞的成骨作用。