1型神经纤维瘤病NF1基因突变研究

摘要

研究背景： 第一部分神经纤维瘤病： 神经纤维瘤病(Neurofibromatosis，NF)，又称冯·雷克林豪森病(vonRecklinghausen disease)。典型神经纤维瘤病表现为神经系统、骨骼和皮肤的发育异常。 临床类型 NF1型:即传统的神经纤维瘤病，占总病例85％以上，表现为大量的神经纤维瘤和咖啡牛奶斑，可见Lisch小结，常不伴发中枢神经系统损害。NF2型:中枢型或听力型，为双侧听神经瘤，咖啡牛奶斑和皮肤神经纤维瘤很少，无Lisch小结。NF3型:混合型，兼有Ⅰ型和Ⅱ型的特征。NF4型:变异型，表现为弥漫性咖啡牛奶斑和神经纤维瘤，可见Lisch小结，可有或无中枢神经系统肿瘤。NF5型:节段型或局限型，神经纤维瘤和咖啡牛奶斑局限于身体的某些特定部位。NF6型:仅咖啡牛奶斑。NF7型:迟发型，30岁以后发病。 病因及发病机制本病NF1型至NF4型均为常染色体显性遗传，不同型别外显率不同，由畸变显性基因引起的神经外胚叶异常，常表现为不全型和单纯型，25％～50％的患者家族史阳性，男性较多见。一般认为NF5型由形成合子后的体细胞突变引起，常不遗传给后代。NF1基因位于17q11.2的中央周围区，编码神经纤维蛋白，该蛋白负调控Ras蛋白转导信号。NF2的基因位于染色体22q12.2，为一种肿瘤抑制基因，编码Merlin蛋白（神经鞘蛋白），该蛋白将肌动蛋白细胞骨架连接到细胞表面的糖蛋白上，起负生长调控作用，具有传导抑制信号的功能。已发现大量NF1基因的突变位点，到目前为止，已经验证的突变位点已达1500余个，突变位点涵盖了大部分NF1的外显子。 临床表现包括皮肤及皮肤以外的损害。 （一）皮肤损害包括皮肤色素斑，神经纤维瘤，及其他皮肤表现。 1.皮肤色素斑咖啡牛奶斑是NF1诊断标准的7个核心标准之一。常出生时即有，偶在出生后数月至1年内发生，常多发，除掌跖外，可不规则散在分布于体表任何部位，因大多数皮损呈咖啡色故称咖啡牛奶斑(Cafe aulait maecule)，呈卵圆或不规则形，大小不一，多随年龄增长而增大、增多。尽管与咖啡加牛奶的颜色相似，但色素的变化从浅棕色至深棕色不等。要符合本病诊断的要求，患者需要六个或更多斑疹，直径＞5mm(青春期前)或＞15mm(青春期后)。不到1％的未患NF1的5岁以下儿童超过两个及以上的斑疹，如果出现多发性咖啡牛奶斑，将高度提示患有NF1。另一项研究发现，有6个或以上咖啡斑的大多数患者最终将达到NF1诊断标准，通常发生在6岁，这可能性随着咖啡斑的数量和典型形态学表现的增加而增加。一般人群咖啡斑的患病率在3％到36％之间（这取决于被研究的人群），另一方面，多发性咖啡斑存在于正常人群的比例一般为1％。腋窝或腹股沟处雀斑样色素沉着亦为本病的特征，称为Crowe征(Crowe's sign)，是NF1核心诊断标准中最特异的一项。它被认为几乎可以确定诊断。但最近的另一项研究提出，斑点可能会出现于一些斑驳病患者，并不一定代表与1型神经纤维瘤病的并存。依据年龄相关的发生频率，它是仅次于咖啡牛奶斑，一般在3至5岁时发生在腋窝和/或腹股沟。其他部位包括颈部和胸部，嘴唇周围，甚至在成人躯干。然而，这些都不满足美国国立卫生研究院的诊断标准。大小从1到3mm大等，可同咖啡牛奶斑区分开来。泛发性色素沉着也可为NF1的皮肤色素改变。 2.神经纤维瘤被认为是NF1另外一个重要的诊断依据，是NF1最常见的表现。由于压迫神经，偶然引起疼痛和进行性功能缺失。神经纤维瘤可发生在身体的任何部位，可以有任何形状，任何大小。皮肤神经纤维瘤在青春期前常不很明显，在整个成人期可能持续生长，包括大小和数量。怀孕是另一个显著生长期。可分为三种类型，即皮肤型、皮下型和丛状型。①皮肤型表现为粉红色、橡胶样有蒂或无蒂的肿瘤，质软，数个至1000个以上，直径从数毫米至数厘米，甚至更大;可累及身体任何部位，但龟头罕见，女性的乳晕和乳头神经纤维瘤对NF1有诊断意义。②皮下神经纤维瘤可硬如象皮。皮肤型和皮下型神经纤维瘤在儿童期开始发生，青春期和妊娠时数量增多，在整个成年期可持续缓慢变大和增多。③丛状型神经纤维瘤出生时即有，对NF1有诊断意义。 3.其他皮肤表现青少年黄色肉芽肿，黑色素瘤，青少年黄色肉芽肿-NF1-青少年髓单核细胞白血病三联征等。 （二）皮肤以外的损害包括口腔损害，神经病变，眼部、骨骼、内分泌、内脏病变，并可能发生恶性肿瘤。1.口腔损害可有口腔肿瘤，发生于上腭、颊粘膜、舌和唇部;或表现为巨舌症。2.神经病变神经缺陷可为局限性或弥漫性、中枢性或外周性。(1)听神经瘤听神经在脑神经中最常受累，听神经瘤双侧发生时可引起感觉神经性耳聋。(2)视神经胶质瘤发生率约占NF1病例的15％，儿童期出现，80％患者无任何症状，少数出现突眼、视力下降或眼球活动受限，大多数病例为非进行性。(3)其他中枢神经系统病变包括脑积水、脑异位、神经胶质小结、神经管闭合、脊髓脊膜膨出、脑和脊髓肿瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、以及星形细胞瘤和脑膜瘤。(4)周围神经损害可出现感觉异常、神经根痛或臂丛麻痹、癫痫、智力障碍、共济失调等。 4.眼病变(1) Lisch小结为虹膜的黑素细胞错构瘤，呈半透明褐色斑点，每只眼平均有25个，常双侧发生，对视力无影响;大多数病例需用裂隙灯检查才能见到;初发于儿童期。Lisch小结很常见，6岁时，15％～20％的儿童和95％的成人有此表现，为美国国家卫生研究院的NF1重要诊断标准之一。(2)其他眼部损害包括脉络膜错构瘤、眼睑神经纤维瘤、双侧视神经萎缩和青光眼，无眼症等。 5.骨骼损害包括蝶骨发育不良，长骨皮质变薄（伴有或不伴有假关节），脊柱后侧凸，胫骨弓形，巨头，矮身材。神经纤维瘤病患者2，5二羟维生素D3血浆水平和骨密度明显下降。组织形态学分析不仅揭示了骨小梁体积下降，而且类骨质体积，成骨细胞和破骨细胞的数量增加。另外，钙含量显著下降。 6.内分泌异常可伴发肢端肥大症、粘液性水肿、性早熟或延迟、Addison病、甲状旁腺功能亢进、甲状腺髓样癌以及嗜铬细胞癌。 7.内脏病变本病根据病变部位，可分为3型:(1)周围型，以多发性皮肤肿瘤和丛状神经纤维瘤为特征，主要累及周围神经，可同时伴内脏和中枢神经系统病变;(2)中枢型，以中枢神经系统和神经根的各种肿瘤的并发为特征，这些肿瘤包括胶质瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤和神经纤维瘤;(3)顿挫型，以肿瘤的数目较少为特点，全身仅几个，以后亦不增多。 8.恶变神经纤维肉瘤，或称恶性神经鞘瘤，可发生于神经纤维瘤病患者，但并不常见。在皮肤神经纤维瘤中者称外周恶性神经鞘瘤(malignantperipheral nerve sheath tumor，MPNST)），更为罕见。 组织病理:(1)咖啡牛奶斑表皮内角质形成细胞及黑素细胞中色素增加，黑素细胞及基底细胞内可见巨大球形黑素颗粒，散在分布，直径可达5μm，多巴(Dopa)反应示黑素细胞密度及活性增加。(2)神经纤维瘤瘤体无包膜，可扩展至皮下脂肪组织，界限常清楚，由神经衣和神经鞘细胞组成，瘤内尚有较多神经轴索增生，小血管丰富。神经鞘细胞呈细长梭形或略弯曲成波形，细胞界限不清，胞质染色呈淡伊红色，两端明显长短不一，排列成波形或涡轮状，间有少数成纤维细胞。特殊染色显示瘤内肥大细胞较多见，常有细长神经纤维穿插于其中，无弹性纤维。丛状神经纤维瘤病累及深部大神经，并见神经束不规则。早期局部神经衣呈黏液瘤样，间质增多，侵袭，并使有髓或无髓神经轴索分隔。神经鞘细胞和胶原纤维增生组成弯曲的条索，周围为黏液样无定形间质。晚期因肿瘤增大，导致正常神经形态无法分辨。 诊断标准包括多种，其中NF1主要使用1988年美国国立卫生研究院建立的关于神经纤维瘤病的诊断标准。基于1988年美国国立卫生研究院关于神经纤维瘤病的总结性报告，1型神经纤维瘤病(NF1)需达到以下标准中2条即可诊断:(1)6个或6个以上的咖啡牛奶色斑;(2)腋部或腹股沟区出现雀斑样改变;(3)2个或2个以上的神经纤维瘤;(4)2个或2个以上Lisch小结;(5)视神经胶质瘤(optic pathway gliomas，OPGs);(6)骨发育异常;(7)一级亲属罹患此病。NF2型神经纤维瘤病的诊断至少需以下1条:(1)CT和MRI检查证明双侧第8对脑神经发生肿瘤;(2)直系亲属患2型神经纤维瘤病以及任何一侧第8对脑神经发生肿瘤，或有以下肿瘤中2种或以上，如神经纤维瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、神经鞘瘤。 预防及治疗:目前无理想的治疗方法。主要对症处理，皮损严重妨碍美容、影响功能者，或肿瘤肿大、疼痛并疑有恶变时可行手术切除。恶性外周神经鞘瘤的标准治疗是手术完整切除。咖啡牛奶斑可选择激光（脉冲染料、YAG、红宝石）治疗。Kim等报道了一例采用切削术联合1444nm Nd∶YAG激光成功治疗多发性皮肤神经纤维瘤。有癫痫发作者应仔细检查病灶，必要时考虑神经外科手术切除，但有复发可能。 第二部分1型神经纤维瘤病 1型神经纤维瘤病(NF1;OMIM#162200)是一种常见的神经皮肤疾病，以多发性咖啡斑，皮肤皱褶处雀斑样改变，Lisch结节，神经纤维瘤为特征。NF1基因编码神经纤维蛋白，已被证实为NF1的致病基因。神经纤维瘤病的发病率约为1/3500。少见的临床表现包括恶性肿瘤，丛状神经纤维瘤，视神经胶质瘤，学习能力障碍，青少年黄色肉芽肿和骨异常。约50％恶性外周神经鞘瘤(MPNSTs)与1型神经纤维瘤相关皮损有关。 90％的NF1病例可发生咖啡斑(Café-au-lait，CAL)，表现为圆形的淡棕色均一的斑疹，直径从1～2mm至20cm不等。最近报道了一例非常罕见的巨大咖啡斑，边界不规则，累及后背的下半部分，右侧面，双侧臀部和大腿。1型神经纤维瘤病另外一个显著特点是神经纤维瘤，可发生在身体任何部位，形状和大小不一。一般来说，神经纤维瘤瘤体在皮肤内呈圆拱形，质软，饱满，皮肤色至轻度色素沉着，而位于皮下者呈坚实的结节状。神经纤维瘤还可发生在产道，若在宫颈可导致宫颈狭窄和下腹部疼痛。 NF1基因，定位于染色体17q11.2，在基因组DNA中约280kb，含有60个外显子，编码神经纤维蛋白，该蛋白由2818个氨基酸残基组成。神经纤维蛋白为Ras的GTP酶活化蛋白GTPase activating protein，GAP)，广泛的表达于多种组织中。迄今为止，已有超过1000个不同的突变被发现，并列于人类突变基因数据库中。大多数突变都导致了截短蛋白(truncated proteins)表达。 研究目的 本研究旨在对1型神经纤维瘤病的致病基因NF1突变及其表型-基因型相关性进行研究。借鉴模式生物的研究成果，利用人类样本明确人类自身NF1基因在1型神经纤维瘤病发病中的基因结构及表达变化，丰富NF1基因突变数据库，为进一步深入阐明NF1基因的生物学功能及1型神经纤维瘤病的遗传咨询，产前诊断，基因诊断和未来的基因治疗奠定基础。利用本研究检测结果，结合既往文献，分析NF1的基因型-表型潜在相关性。 研究材料和方法： 抽取两个1型神经纤维瘤病家系、三个散发病例及100例无亲缘关系的正常对照的外周血，提取DNA，设计引物，对NF1基因编码的外显子及外显子内含子交界区域进行基因扩增，PCR产物纯化，并采用Sanger法进行测序，利用BioEdit软件分析比对研究对象的基因序列有无杂合突变，并与基因数据库正常序列进行比对，分析有无纯合突变，同时与SNP数据库和100例正常对照的序列比对排除多态性。通过比较临床和突变数据来分析NF1基因型和表型的潜在相关性。 结果： (1)临床发现 所有患者出生时即出现咖啡斑。家系1先证者，女，3.5岁，躯干、四肢和臀部可见散在分布的咖啡斑

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 研究材料

2．2 研究方法

第三章 结果

3．1 临床发现

3．2 实验室结果

第四章 结论

第五章 讨论

参考文献

研究不足之处及后续研究方向

综述一 神经纤维瘤病研究进展

综述二 NF1基因研究进展

中英文缩略词对照表

攻读博士学位期间成果

致谢

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