含c(RGDfk)环肽的自组装纳米复合物RPM/siRNA在肿瘤靶向治疗中的应用

摘要

背景:
　　双链的小分子干扰RNA通过抑制特异性mRNA的转录所引起的基因沉默，被称作是RNA干扰（RNAi），而且RNA干扰技术已经使用了很长的一段时间。小分子干扰RNA已经引起了广泛的关注，因为它在多种疾病中有着非常有前景的治疗效果，例如神经系统疾病，传染病和各种癌症。但是，小分子干扰RNA技术在应用到临床环境之前仍然面临着一系列的障碍，这些障碍主要与以下问题相关，例如:由于血清中酶的降解而导致的很差的药代动力学特征;细胞摄取率低;快速消除和没有靶向特定的细胞类型的能力。因此，设计出能够有效的运载特异性的siRNA到靶组织的载体仍然是一个巨大的挑战，同时也是许多研究的热点。如今，有许多可以自组装形成超分子复合物的非病毒载体已经被设计用来递送小分子干扰RNA。例如，脂质体，脂质体复合物，稳定的核酸-脂质颗粒，阳离子聚合物和肽类等已经被利用来保护小分子干扰RNA，以避免其在转运过程中被不必要的降解。而且，这些载体可以被不同的靶向性配体所修饰从而提高它们的组织靶向能力，这些配体包括:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD肽），叶酸，转体和抗体。RGD肽及其结构相关的化合物是研究最多的配体，它们属于整合素配体家族。大量的研究发现与肿瘤相关的整合素αvβ3受体和RGD肽具有高度的亲和力。当在体内使用时，我们发现以环肽c(RGDfk)为基础的，特性性地靶向于整合素αvβ3受体的小分子(RPM)载体可以介导小分子干扰RNA聚集在肿瘤部位，从而发挥肿瘤的靶向治疗作用。
　　抑制新生血管的形成，可以阻断肿瘤的营养供应和产生废物的排出，从而导致肿瘤的生长、侵袭和转移都受到抑制，这种方法已经被广泛地使用于抗肿瘤的研究中。血管内皮生长因子(VEGF)，也称作血管通透性因子，在血管的形成中发挥着非常重要的作用，其可以特异性的结合血管内皮生长因子受体2(VEGFR2，也称作KDR/Flk-1，一种酪氨酸激酶受体)，然后激活下游信号通路，导致血管内皮细胞迁移和增殖，从而促进新生血管生成和血管生长。因此，抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)在新生血管中的表达是肿瘤治疗的一种有效方法。
　　在这篇研究中，RPM被发现可以自组装形成纳米粒，并可以被用于有效的小分子干扰RNA转运。我们研究了这种携带了siRNA的纳米复合物的各种特征，而且在体外和体内都证明了RPM/VEGFR2-siRNA纳米复合物的基因沉默功能。我们获得了两个水平的靶向性:通过配体c(RGDfk)环肽靶向性地结合在新生血管中高表达的整合素α vβ3受体:通过小分子干扰RNA寡核苷酸实现基因通路上的选择性。具我们所知，这是第一个展示了含环肽c(RGDfk)的小分子化合物RPM具有自组装的能力并且可以有效的运载小分子干扰RNA到达靶组织部位的研究。
　　目的:
　　1.制备RPM/siRNA纳米复合物，并研究其表征和特性。
　　2.体外研究RPM/siRNA纳米复合物的细胞靶向性，细胞内的分布，细胞毒性和基因沉默功能。
　　3.体内研究RPM/siRNA纳米复合物抑制斑马鱼血管生成的作用。
　　4.体内研究RPM/siRNA纳米复合物肿瘤组织的靶向性:经尾静脉系统给药后，在不同时间点，观察纳米复合物所携带的Cy5荧光标记的siRNA在荷瘤裸鼠体内的动态分布和肿瘤靶向性。
　　5.RPM/siRNA纳米复合物抑制肿瘤生长的功能及其机制研究:研究经尾静脉系统途径给予RPM/siRNA纳米复合物后抑制肿瘤生长的生物学功能，及其作用机制（抑制血管生成、导致基因沉默）;同时通过对免疫因子和血液化学成分的检测来评价体内给予RPM/siRNA纳米复合物后的安全性。
　　方法:
　　1.RPM/siRNA纳米复合物的制备，以及纳米复合物的表征和特性的研究RPM的合成和纯化由美国PEPTIDES INTERNATIONAL公司完成，将RPM溶液与小分子干扰RNA溶液混合孵育即得到RPM/siRNA纳米复合物。使用投射电镜来观察纳米复合物的形态，电荷和粒径分析仪来检测纳米复合物的带电情况和粒径大小，并使用元二色谱来探索RPM分子在形成纳米复合物时的二级结构。同时，研究了RPM/siRNA纳米复合物在血清中的稳定性。
　　2.RPM/siRNA纳米复合物体外功能的研究
　　使用共聚焦显微镜来检测标记了Cy5的siRNA分子在细胞内的分布情况，从而验证RPM/siRNA纳米复合物能靶向性地进入到表达整合素αvβ3受体的细胞中。通过对Cy5荧光的识别，采用流式细胞分析技术，检测不同比例的RPM与siRNA-Cy5混合后所形成的纳米复合物介导siRNA进入细胞内的量，从而取得最佳使用配比。采用CCK-8检测试剂盒来评价RPM/siRNA纳米复合物的体外细胞毒性。为了评价RPM/siRNA纳米复合物在体外细胞中的基因沉默功能，分别采用RT-qPCR和western blot技术从mRNA和蛋白水平来验证。用One-WayANOVA进行统计学分析;根据方差是否齐性选择LSD或者Dunnett T3检验，比较各组之间的差异。
　　3.RPM/siRNA纳米复合物抑制斑马鱼血管生成的研究
　　本研究选用flk-1:GFP转基因的斑马鱼和野生型的斑马鱼作为模型生物。在显微镜下挑选出发育良好的斑马鱼胚胎(10hpf)，放入6孔板中，每孔为20个。通过显微注射分别将RPM/siRNA纳米复合物(zVEGFR2，2 nl)，RPM/ControlsiRNA纳米复合物(2 nl)，裸的siRNA(zVEGFR2，2 nl)或ddH20(2nl)注射进10 hpf的斑马鱼胚胎。然后置于28.5℃孵育，在72hpf时，采用共聚焦显微镜观察各组斑马鱼血管的发育状况。采用相对荧光强度对斑马鱼血管发育的情况进行定量分析。以Adobe Photoshop7.0软件记录多层扫描投射荧光集合(Z-stack Projection)。以灰度平均值记为荧光亮度，结果以各组荧光亮度与对照组之比进行统计分析。相对荧光强度以ddH20处理组为空白对照组。
　　结果:
　　1.RPM/siRNA纳米复合物的表征和特性
　　本课题通过简单的方法制备了RPM/siRNA纳米复合物，纳米复合物的形成机制如图1-1所示，并对其表征和特性进行了研究:投射电镜结果显示，RPM/siRNA纳米复合物呈圆球形，而且粒径小于100nm;电位和粒度分析仪测得RPM/siRNA纳米复合物的粒径范围为105.7nm～141.8nm，且粒径分布范围较窄。其zeta电位为负电性，为-6.16 mV。元二色谱显示RPM/siRNA纳米复合物的二级结构组成为β折叠和自由卷曲，其中β折叠占主要部分。血清稳定性试验显示，RPM/siRNA纳米复合物中的siRNA分子的降解明显比裸的siRNA分子缓慢，在12个小时时仍有部分未降解。
　　2.RPM/siRNA纳米复合物的体外功能
　　(1)共聚焦显微镜的结果显示在转染RPM/siRNA-Cy5纳米复合物6h以后，HUVEC细胞和A549细胞的胞质中都存在大量Cy5荧光信号，而在用整合素αvβ3特异性抗体封闭以后再转染的HUVEC细胞中则无Cy5荧光信号出现，同时阴性肽对照组RAPM/siRNA-cy5也没有信号进入到HUVEC细胞中。流式细胞检测结果显示不同量的RPM和同样量的siRNA-Cy5分子混合后转染进入HUVEC细胞中的siRNA-Cy5分子的量不同，荧光强度达到最大时，RPM和siRNA-Cy5分子的体积比为1.5∶1.
　　(2)处理后的细胞在37℃孵育24小时以后，用试剂盒测得细胞的活性在RPM组，RPM/siRNA纳米复合物组和未处理组之间无显著性差异（P＞0.05），而阳性对照(Lipofectamine2000)/siRNA复合物组细胞的相对活性约为50％，跟其他组相比均有显著性差异P＜0.05)。
　　(3)RT-qPCR结果显示在转染48小时以后，RPM/siRNA纳米复合物转染组和阳离子脂质体转染组(Lip02000/siRNA)靶基因mRNA的表达量分别为～38％和～39％，二者间无统计学差异（P＞0.05），但两组与未处理组以及阴性对照组相比均有显著性差异(P＜0.05);Western blot结果表明，在转染48小时以后，两组靶蛋白的表达率分别为～29％和～36％，二者间无统计学差异（P＞0.05），但两组与未处理组以及阴性对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.RPM可与siRNA分子通过自组装形成球形纳米复合物，制备过程简单，而且纳米复合物的血清稳定性好。
　　2.RPM/siRNA纳米复合物可特异性地进入表达整合素αvβ3受体的细胞中，提示该纳米复合物可经受体介导而进入细胞;并能有效地沉默靶基因。
　　3.RPM/siRNA纳米复合物没有明显的细胞毒性。
　　4.RPM/siRNA纳米复合物可以通过整合素αvβ3受体的介导，有效地抑制斑马鱼胚胎新生血管生成。
　　5.RPM/siRNA纳米复合物经裸鼠尾静脉注射给药后，可靶向于裸鼠的肿瘤部位，通过对靶基因的沉默而抑制新生血管的生成。
　　6.RPM/siRNA纳米复合物可有效地抑制裸鼠肿瘤生长，其机制为抑制肿瘤相关基因的表达(VEGFR2)，抑制抗肿瘤部位新生血管的生成等。
　　7.体内试验表明RPM/siRNA纳米复合物无免疫刺激、无明显的肝肾毒性，具有一定的安全性。

目录

摘要

引言

第一章 RPM／siRNA纳米复合物的制备和表征特性研究

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第二章 RPM／siRNA纳米复合物体外功能的研究

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第三章 RPM／siRNA纳米复合物抑制斑马鱼新生血管的生成

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 小结

第四章 RPM／siRNA纳米复合物体内肿瘤靶向性、抗肿瘤生物学功能及其作用机制的研究

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 小结

全文总结

全文讨论

参考文献

综述

攻读博士期间研究成果

致谢

统计学证明

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