检测18种（型/亚型）呼吸道病毒的两种反应实时荧光定量PCR的建立及其在流行病学调查中的应用

摘要

本研究分为三部分:
　　一、检测18种（型/亚型）呼吸道病毒的两种反应实时荧光定量PCR的建立
　　临床常见的呼吸道病毒种类众多，感染的临床表现相似，根据临床症状难以进行病原学鉴别诊断。根据文献报道的引物和探针，成功建立了2种不同反应条件实时荧光定量PCR方法检测18种（型/亚型）呼吸道病毒。通过验证该法的敏感性和特异性、准确性，结果显示，该法的最低检测限为10拷贝数/μL，变异系数(CV)为1.27％～3.44％，且特异性良好。经检测408份呼吸道标本，鼻拭子检测的阳性率为63.2％(225/356)，肺泡灌洗液检测的阳性率为25％(13/52)。说明建立的real-time PCR法简便、特异、灵敏、稳定。
　　二、2011-2014年广州市4种常见冠状病毒的流行病学调查及2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠状病毒的调查
　　通过上述的Real-time PCR方法检测18种（型/亚型）呼吸道病毒，分析2011-2014年广州市发热呼吸道症候群患者中229E、OC43、NL63、HKU1的流行病学情况。结果表明，4种冠状病毒的总检出率为4.42％(104/2355)，HCoV合并HRV(17.3％，18/104)及HCoV合并RSV(14.4％，15/104)感染最常见;不同年龄组(P=0.188＞0.05)、不同来源标本(P=1.000＞0.05)中4种常见人类冠状病毒的检出率无明显差异。2011年11月-2014年12月HCoVs流行情况大致为HCoVs各季节均有分布;其中OC43和NL63主要分布于2012年和2014年，呈两年一次高峰期的典型特征，OC43各季节均有分布，但NL63主要集中于夏秋季(6-10月);229E与HKU1呈散在分布。HCoV感染患者最常见的临床症状为发热。大部分(66.3％)患者出现了下呼吸道感染，甚至出现重症肺炎(6.73％)及死亡病例(1.92％)，说明HCoV感染不仅引起轻型呼吸道症状，还会引发严重疾病。
　　此外，我们还通过通用型巢式PCR及基因测序，对2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠状病毒进行调查，以筛查出新型冠状病毒。结果显示，不明原因肺炎患者272份呼吸道标本（鼻拭子标本数n=204，肺泡灌洗液n=68）中，均无检测出新型冠状病毒。然而，由于重症肺炎及死亡病例在不明原因肺炎中分别占9.93％(27/272)和3.68％(10/272)，提示UP可引发严重疾病。
　　三、10年前后SARS患者核衣壳蛋白抗体效价变化的血清学研究
　　以实验室前期Bac-to-Bac杆状病毒系统表达的重组SARS-NP作为抗原，进一步优化建立间接ELISA法，检测10年前后SARS患者恢复期血清中SARS-NP特异性IgG，分析SARS-NP IgG水平变化情况。实验表明，基于杆状病毒表达的间接ELISA法与其它病原体无交叉反应。532份体检者血清中，间接ELISA检出率为1.13％(6/532)，经Western blot确证阳性率为0.75％(4/532)。该法的假阳性率为0.38％，特异性为99.62％。同时测定了13名SARS患者10年前后的血清，总检出率为95％（57/60，n=60，n表示13名SARS患者10年前、后的总血清标本数），即敏感度为95％;10年前的血清检出率为98.2％（54/55，n=55，n表示13名SARS患者10年前的血清标本数）;10年后的血清（n=5，n表示上述其中5名SARS患者10年后的血清标本数）中，仅3份检测为阳性。此外，5名SARS患者10年前SARS-NP IgG最高效价由1∶160到1∶5120不等，10年后SARS-NP IgG最高效价由1∶10-1∶160不等。10年前后SARS患者体内SARS-NP IgG水平呈明显的下降趋势，但部分患者SARS-NP IgG抗体效价仍很高，说明SARS-NP IgG可长期存在于患者体内。
　　小结：
　　综上所述，本研究的必要性及意义如下:
　　1.本研究成功建立了检测18种（型/亚型）呼吸道病毒的两种反应的real-time PCR并进行了临床标本评估。本方法简便，涵盖的病毒种类多，成本低，且具有临床应用价值，并为发热呼吸道症候群监测平台的建立及其在流行病学中的应用提供了有力的技术支持。
　　2.分析发热呼吸道症候群患者中229E、OC43、NL63、HKU1的流行病学特征及临床特征，对不明原因肺炎患者中新型冠状病毒及临床特征进行调查，实时监测呼吸道病原体的构成及流行特征，对预防预警重大传染病及新发传染病的发生发展有重要的意义。
　　3.建立基于杆状病毒表达重组SARS-NP的间接ELISA法检测SARS-NP特异性抗体，调查SARS患者10年前后血清中SARS-NP抗体水平的变化趋势以及体检者血清中SARS-NP抗体的检出情况。该法既可作为应对SARS再次流行的储备诊断方法，还可用于血清学研究观察抗体水平变化，有助于进一步了解机体对SARS的体液防御机制。

目录

摘要

前言

第一章 检测18种(型／亚型)呼吸道病毒的两种反应实时荧光定量PCR的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 2011-2014年广州市4种常见冠状病毒的流行病学调查及2013-2014年不明原因肺炎患者中新型冠状病毒的调查

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 SARS患者核衣壳蛋白抗体效价10年前后变化的血清学研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

全文小结

参考文献

综述 呼吸道合胞病毒感染发病机制的研究进展

缩写词简表

研究期间所发表论文情况

致谢

声明