长链非编码RNA PTTG3P促进肝癌细胞生长和转移及其相关机制研究

摘要

目的：
　　肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肝脏恶性肿瘤，进一步明确HCC发生发展的分子机制，找到潜在的诊断和治疗分子靶点，有望为HCC的防治提供新思路，具有重要的临床意义。
　　长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是近年来发现的与众多疾病的发生发展密切相关的新型RNA分子。人类基因组中只有约1％的基因为蛋白质编码基因，约4％～9％的基因转录但其转录本不能编码蛋白质，其中长度大于200nt（核苷酸单位）的非编码转录本被定义为lncRNA。
　　本研究通过基因芯片技术发现一种在肝癌组织和癌旁组织中差异表达的新lncRNA分子—PTTG3P（pituitary tumor-transforming3，pseudogene，垂体瘤转化因子3假基因），研究其在肝癌中的表达情况及临床意义，以及其对肝癌细胞增殖、凋亡和转移能力的影响，进一步探宄其具体的作用机制，旨在为肝癌的诊断和治疗提供新的靶点。
　　方法：
　　1.LncRNA PTTG3P的筛选、表达验证及其临床意义；
　　2.LncRNA PTTG3P的功能研究；
　　3.LncRNA PTTG3P促进肝癌细胞生长和转移的可能分子机制研究。
　　结果：
　　1.基因芯片筛选得到lncRNA PTTG3P，PTTG3P在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织，并且其表达量与年龄呈负相关，与肿瘤大小呈正相关。
　　1.1.基因芯片筛选得到大量差异表达的lncRNA，其中lncRNA PTTG3P在肝癌组织中表达上调。
　　在3例经病理确诊为中分化HCC的肝癌组织和其相应的癌旁组织标本中进行lncRNA和mRNA表达谱芯片分析，通过生物信息学分析，筛选得到癌组织和癌旁组织中差异表达大于1.5倍且p＜0.05的lncRNA共822个，其中513个lncRNA表达上调，209个lncRNA表达下调。差异表达大于1.5倍且p＜0.05的mRNA共979个，其中449个基因表达上调，530个基因表达下调。Pathway分析结果显示，mRNA的表达变化主要与细胞周期的变化有关。在差异表达的lncRNA中， lncRNA PTTG3P在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，差异表达倍数为11.87，p=0.0016。
　　1.2.LncRNA PTTG3P在肝癌组织中表达明显上调。
　　我们通过RT-PCR检测了PTTG3P在46例肝癌组织和配对癌旁组织中的表达水平，结果显示PTTG3P在肝癌组织中明显表达上调(p＜0.05)。
　　1.3.LncRNA PTTG3P表达量与年龄成负相关，与肿瘤大小呈正相关
　　通过对PTTG3P表达量和46例HCC患者的临床资料进行分析，我们发现PTTG3P表达量与HCC患者的年龄呈负相关(p＜0.05)，与肿瘤大小呈正相关(p＜0.05)，而与性别、AFP水平、肝硬化情况、HBsAg、肿瘤个数、病理分级等无明显相关。
　　2.LncRNA PTTG3P能够促进肝癌细胞生长和转移。
　　2.1.成功构建稳定过表达和稳定干扰PTTG3P的HepG2和Hep3B肝癌细胞株。
　　对转染PTTG3P过表达慢病毒载体和对照慢病毒载体的HepG2和Hep3B细胞中PTTG3P的表达量进行RT-PCR检测，结果发现转染过表达PTTG3P慢病毒载体的HepG2和Hep3B细胞中PTTG3P的表达量明显高于对照细胞株(p＜0.05)，表明稳定过表达PTTG3P的HepG2和Hep3B细胞以及对照细胞株均已成功构建。同时，利用慢病毒稳定干扰HepG2和Hep3B细胞内源性PTTG3P的表达，应用RT-PCR检测其稳定干扰效率，结果显示，在HepG2细胞内，PTTG3P干扰效率为34.53％(p＜0.05)，在Hep3B细胞中为35.03％(p＜0.05)，表明稳定低表达PTTG3P的HepG2和Hep3B细胞以及对照细胞株已成功构建。
　　2.2.LncRNA PTTG3P促进HepG2和Hep3B肝癌细胞的生长
　　CCK-8实验结果显示过表达PTTG3P能够促进细胞生长(p＜0.05)而干扰PTTG3P则抑制肝癌细胞生长(p＜0.05)。平板克隆形成实验也进一步证实了该结果(p＜0.05)。EdU实验进一步说明，PTTG3P能够促进肝癌细胞进入S期(p＜0.05)。流式细胞术的结果也证实，PTTG3P能够减少处于G1期的细胞数(p＜0.05)，增加处于S和G2期的细胞数(p＜0.05)。这些结果表明PTTG3P能够促进肝癌细胞G1/S的转换，从而促进细胞增殖。此外，通过流式细胞仪检测凋亡，结果显示干扰PTTG3P能够明显增加凋亡细胞比例(p＜0.05)，而过表达PTTG3P则能减弱5氟尿嘧啶诱导的肝癌细胞凋亡(p＜0.05)。在裸鼠皮下成瘤实验中，Lv-PTTG3P HepG2细胞形成的肿瘤的重量和体积都明显大于对照组(p＜0.05)，而sh-PTTG3P组肿瘤的重量和体积均小于sh-con对照组(p＜0.05)。这些结果说明PTTG3P能够在体内和体外促进肝癌细胞的生长。
　　2.3.LncRNA PTTG3P促进肝癌细胞的转移
　　Transwell小室迁移实验结果表明过表达PTTG3P显著促进HepG2和Hep3B细胞的迁移能力(p＜0.05)而干扰PTTG3P后，HepG2和Hep3B细胞的迁移能力明显减弱(p＜0.05)。在Boyden小室侵袭实验中，PTTG3P过表达能够明显增加穿过膜的肝癌细胞数(p＜0.05)，然而，干扰PTTG3P后，穿膜细胞数明显少于对照组(p＜0.05)。在裸鼠肝转移模型实验中，分别在裸鼠脾脏内注射sh-PTTG3P和sh-con HepG2细胞，30天后处死裸鼠，发现sh-PTTG3P组裸鼠在肝脏内形成的转移瘤数量明显少于sh-con组。
　　3.PTTG3P通过激活PI3K/AKT信号通路，调控一系列与增殖、凋亡和EMT相关的基因表达，从而促进肝癌细胞的生长和转移。
　　运用western blot技术检测稳定干扰PTTG3P和稳定过表达PTTG3P的HepG2细胞中与细胞增殖相关的关键基因(C-myc、CyclinD1、CDK4、CDK6、Rb和p-Rb)的表达情况，结果显示过表达PTTG3P能够明显升高C-myc(p＜0.05)、CyclinD1(p＜0.05)和p-Rb(p＜0.05)的水平，反之，干扰PTTG3P则能明显下调C-myc(p＜0.05)、CyclinD1(p＜0.05)和p-Rb(p＜0.05)的水平。PTTG3P对CDK4、CDK6和Rb的表达水平无明显影响。这说明PTTG3P可通过上调C-myc和CyclinD1的表达，进而升高p-Rb的水平，最终促进肝癌细胞的增殖。
　　凋亡关键基因Caspase3和Cleaved Caspase3的western blot结果表明，干扰PTTG3P能够增加Cleaved Caspase3的活性(p＜0.05)，而过表达PTTG3P则能够抑制5氟尿嘧啶诱导的Cleaved Caspase3活性(p＜0.05)。
　　EMT是影响细胞迁移和侵袭能力的一个重要方面。对EMT相关指标进行western blot检测，结果显示，在过表达PTTG3P的肝癌细胞中，核转录因子Snail、Slug蛋白质水平明显升高(p＜0.05)，上皮标志物E-cadherin表达下调(p＜0.05)，间质标志物N-cadherin则表达无明显变化。而在sh-PTTG3P肝癌细胞中，Snail(p＜0.05)、Slug(p＜0.05)表达水平降低，E-cadherin表达水平升高(p＜0.05)，N-cadherin表达无明显变化。这些结果表明PTTG3P可通过上调Snail和Slug的表达，下调E-cadherin的表达，从而促进肝癌细胞的EMT过程，
　　Western blot检测了PTTG3P对细胞中相关信号通路蛋白的影响，结果发现，在HepG2细胞中，过表达PTTG3P能够引起磷酸化蛋白质p-PI3K(p＜0.05)和p-AKT(p＜0.05)水平升高，而干扰PTTG3P则能够降低p-PI3K(p＜0.05)和p-AKT(p＜0.05)的水平。这说明过表达PTTG3P能够激活PI3K/AKT信号通路，而干扰PTTG3P则抑制PI3K/AKT信号通路。
　　结论：
　　1.LncRNA PTTG3P在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织，且其表达量与患者年龄呈负相关，与肿瘤大小呈正相关。
　　2.LncRNA PTTG3P能够在体内和体外促进肝癌细胞的生长和转移。
　　3.LncRNA PTTG3P能够激活PI3K/AKT信号通路，调控一系列与周期相关的基因（上调C-myc、CyclinD1和p-Rb的表达）、凋亡相关基因（下调CleavedCaspase3的活性）和EMT相关基因（上调Snail和Slug的表达，下调E-cadherin的表达）的表达，从而促进肝癌细胞的生长和转移。

目录

摘要

前言

第一章 LncRNA PTTG3P的筛选、表达验证及其临床意义

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第二章 LncRNA PTTG3P在肝癌细胞生长和转移中的作用

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

第三章 LncRNA PTTG3P促进肝癌细胞生长和转移的分子机制研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

全文总结

参考文献

英文缩略词表

在读期间己发表和待发表的论文

致谢

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