c-Met抑制剂17-AAG和卡博替尼对小鼠体内产单核细胞李斯特菌感染的阻断作用

摘要

目的：
　　通过小鼠动物体内试验，研究c-Met抑制剂17-AAG和卡博替尼对李斯特菌体内感染的阻断作用，探讨c-Met抑制剂作为李斯特菌感染治疗药物的可行性，寻找细胞内细菌感染的治疗新策略。
　　方法：
　　一、17-AAG对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用
　　1、生存曲线分析
　　将小鼠随机分为4组:17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组，每组8只，每只小鼠腹腔注射1×106CFU李斯特菌，并分别在感染后6h、12h、24h给药，分别腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG5μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS。
　　2、血液、脑、肝、脾细菌计数
　　(1)剂量依赖效应
　　取24只小鼠，将小鼠随机分为0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四种剂量组，每组6只。
　　(2)协同作用
　　取24只小鼠，随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组，每组6只。
　　3、循环血脑微血管内皮细胞(cBMECs)的计数
　　(1)剂量依赖效应
　　小鼠随机分为0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四种剂量组，每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分别于给菌前2h和给菌后24h腹腔注射相应剂量17-AAG，给菌后48h解剖小鼠，取心脏血液，并裂解红细胞。
　　(2)协同作用
　　小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组，每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分别在感染后2h、6h、24h给药，各组分别腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG5μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS，给菌48h后，解剖取其心脏血，计数cBMECs。
　　4、脑组织中依文思蓝(EB)含量的测定
　　(1)剂量依赖效应
　　小鼠随机分为不同17-AAG剂量组，给菌给药，方法同2(1)，于解剖前3h腹腔注射EB(50μg/g)，存活3h后，麻醉，用30mL预冷PBS心脏灌注，打开头颅，取出脑组织，放入含有1mL去离子甲酰胺的EP管内，50℃水浴48h，5200rpm离心10min，取上清液，620nm分光光度计测定吸光度，根据吸光度在绘制的标准曲线中查得EB的浓度。
　　(2)协同作用
　　小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组，给菌给药，方法同2(2)，于解剖前3h腹腔注射EB，测定脑组织中EB含量。
　　5、脑脊液(CSF)中NF-κB p65的测定
　　(1)剂量依赖效应
　　小鼠随机分为不同17-AAG剂量组，给菌给药，方法同2(1)，给菌48h后，解剖小鼠，取出小鼠脑组织，用200μLPBS冲洗脑室和颅腔以收集脑脊液，10μLCSF中含有10个红细胞的标本视为污染标本，然后用小鼠NF-κB p65ELISA试剂盒测定脑脊液中p65的含量。
　　(2)协同作用
　　小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组，给菌给药方法同2(2)，给菌48h后，取其CSF测定p65含量。
　　6、IL-10的检测
　　小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组，给菌用药方法同2(2)，给菌48h后，解剖小鼠，采集心脏血，于2-8℃5200rpm离心15分钟，30分钟内收集好血清，用IL-10 ELISA试剂盒检测IL-10含量。
　　7、肝脏病理学分析
　　采集PBS对照组和10μg/g17-AAG剂量组小鼠肝脏组织，于10％甲醛固定后，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、贴片、烤片、HE染色、封片后，于显微镜下进行病理观察。
　　二、卡博替尼对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用
　　1、生存曲线分析
　　将小鼠随机分为4组:卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组，每组9只，每只小鼠腹腔注射1×106CFU李斯特菌，并分别在感染后6h、12h、24h给药，各组分别灌胃给予卡博替尼20μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS，每天记录观察小鼠的临床症状和生存情况，共5d。
　　2、血液、脑组织细菌计数
　　(1)剂量依赖效应
　　将小鼠随机分为0、10μg/g、20μg/g、30μg/g卡博替尼四种剂量组，每组5只。每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分别于给菌前2h和给菌后24h灌胃相应剂量卡博替尼。给菌后48h，给予小鼠10％水合氯醛200μL，打开其胸腔，从心尖处抽取200μL血液，倍比稀释后，涂布于BHI固体培养基进行细菌计数。灌洗后无菌打开头颅，取出脑组织，用组织匀浆器研磨，倍比稀释后，计数细菌菌落数。
　　(2)协同作用
　　将小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组，每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌，分别在感染后2、6、24h给药，各组分别灌胃给予卡博替尼20μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS，给菌后48h，无菌取其血液和脑组织，计数细菌菌落数。
　　3、循环血脑微血管内皮细胞的计数
　　小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组，给菌给药方法同2(2)，感染李斯特菌48h后，解剖取其心脏血，并裂解红细胞。按照说明书准备好磁珠，并用Hanks平衡盐溶液和5％FBS混合液(HBSS+5％FCS)重悬至终浓度为4×108个/mL。
　　4、IL-10的检测
　　小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组，给菌用药方法同2(2)，给菌48h后，采集心脏血，于2-8℃5200rpm离心15分钟，30分钟内收集好血清，用IL-10ELISA试剂盒检测IL-10含量。
　　5、脑脊液中NF-κB p65的测定
　　小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组，给菌用药方法同2(2)，解剖小鼠，取出小鼠脑组织，用200μLPBS冲洗脑室和颅腔以收集脑脊液(CSF)，10μLCSF中含有10个红细胞的标本视为污染标本，然后用小鼠NF-κB p65 ELISA试剂盒测定脑脊液中p65的含量。
　　6、脑组织中依文思蓝含量的测定
　　小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组，给菌给药方法同2(2)，小鼠于解剖前3h腹腔注射EB（50μg/g），存活3h后，麻醉，用30mL预冷PBS心脏灌注，打开头颅，取出脑组织，放入含有1mL去离子甲酰胺的EP管内，50℃水浴48h，5200rpm离心10min，取上清液，620nm分光光度计测定吸光度，根据吸光度在绘制的标准曲线中查得EB的浓度。
　　7、脑组织病理学分析
　　采集脑组织，于10％甲醛固定后，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、贴片、烤片、HE染色、封片后，于显微镜下进行病理观察。
　　统计学分析
　　本研究的数据采用均数±标准差表示，两组的比较运用t检验，运用GraphPadPrism5软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，检验水准为α=0.05。
　　结果：
　　一、17-AAG对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用
　　1.17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组感染小鼠的生存率均明显高于PBS对照组。
　　2.17-AAG呈剂量依赖性抑制李斯特菌在小鼠血液、脑组织、肝脏、脾脏的增殖，并呈剂量依赖性减少血液cBMECs数量、脑组织中EB含量、脑脊液中NF-κB p65含量。
　　3.17-AAG联合氨苄青霉素组相比单独用药组，小鼠血液、脑组织、肝脏、脾脏的李斯特菌数量、cBMECs数量、脑组织中EB含量、脑脊液中NF-κB p65含量均显著降低。
　　4.17-AAG用药组相比PBS对照组，小鼠肝脏组织病理变化减轻。
　　二、卡博替尼对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用
　　1.卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组感染小鼠的生存率明显高于PBS对照组。
　　2.卡博替尼呈剂量依赖性降低感染小鼠血液、脑组织中李斯特菌数量。
　　3.卡博替尼联合氨苄青霉素用药组相比于单独用药组，外周血cBMECs数量、脑组织中EB含量、脑脊液中NF-κB p65含量、血液IL-10含量均显著降低。
　　4.联合用药组和单独用药组脑组织炎症变化均较PBS组减轻，其中联合用药组仅见少量的炎症细胞。
　　结论：
　　c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂17-AAG和卡博替尼能够在一定程度上抑制李斯特菌在小鼠体内增殖，阻断李斯特菌菌血症和脑膜炎的发生，并与氨苄青霉素可能具有一定程度上的协同作用。

目录

摘要

前言

第一章 17-AAG阻断小鼠体内产单核细胞李斯特菌感染的实验研究

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 卡博替尼阻断小鼠体内产单核细胞李斯特菌感染的实验研究

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

全文总结

参考文献

英文缩略词表

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致谢

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