微生物酯酶的酶学性质鉴定及其在手性化合物合成中的应用研究

摘要

酯酶是一种重要的工业酶,能够催化酯化、转酯及水解等多种生物化学反应,广泛应用于食品、生物医药、精细化工、农业及环境治理等领域.酯酶和脂肪酶因具有高立体选择性而常被用来制备手性药物及其中间体.本研究分别从一株土壤来源的细菌及一株海洋来源的细菌中克隆、表达了一个新颖酯酶EstP8和EstC10,并对其酶学性质进行了研究.同时发现它们都具有手性拆分功能. 从假单胞菌Pseudonocardia antitumoralisHUP007基因组中克隆了酯酶EstP8基因,并在E.coli中实现了高效的表达.进化树分析结果表明,EstP8为脂肪酶家族Ⅳ中的一员.酯酶EstP8酶学性质研究表明,EstP8最适底物为对硝基苯酚乙酸酯(p-NPC2),最适温度和pH分别为50℃和8.0.EstP8催化p-NPA水解反应的活性、Vmax和Km分别为达到105.19U/mg、89.4μM/min、1.144mM.辛烷、庚烷、甲苯、丙酮、DMF等有机溶剂及Cu2+、Mn2+、Zn2+等金属离子对EstP8的活性具有激活作用.由此可以看出,EstP8具有良好的有机溶剂及金属离子耐受性.酯酶EstP8还可以通过水解拆分高效的制备手性(R)-1-苯基乙醇;在共溶剂甲苯的存在下,所制备的(R)-1-苯基乙醇的e.e.和产率可达91%和18%;在共溶剂DMSO的存在下,所制备的(S)-乙酸苏合香酯的e.e.和产率可达98%和60%. EstC10是从西太平洋深海微生物Bacillussp.CX01中分离鉴定的一个酯酶.经进化树分析,EstC10属于第(ⅩⅢ)家族.酶学性质研究表明,EstC10的最适反应底物为p-NP C2,酶活力为310U/mg.EstC10的最适pH和温度分别为8.0和35℃.异辛烷和正己烷对EstC10的活性具有促进作用.Tween-20和三聚磷酸钠对EstC10的活性同样具有激活作用,而Cu2+和Zn2+却抑制EstC10的活性. EstC10能够选择性的水解2-氯丙酸甲酯产生(R)-2-氯丙酸甲酯.通过对pH、温度、有机共溶剂、表面活性剂、底物浓度、反应时间等条件的优化,(R)-2-氯丙酸甲酯的对映体过量值可达99%.目前,关于利用酯酶对2-氯丙酸甲酯进行手性拆分的报告非常少.因此,酯酶EstC10具有巨大的潜在应用价值.

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