FSCN1对五指山小型猪骨髓间充质干细胞迁移能力的影响

摘要

五指山小型猪(WZSP)是我国特有的优质猪种，其各项生理指标均与人类接近，是理想的实验动物模型。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是由中胚层分化而来的一种非造血成体干细胞，它能够在体外贴壁生长，在合适条件下可以大量扩增并分化成为问充质细胞(Mesenchyma cell，MC)，并继续分化为骨、软骨、脂肪、成纤维、血管内皮细胞等各种结缔组织细胞。细胞迁移是细胞生物学研究的重要课题之一，其在细胞觅食、伤口痊愈、癌症转移等生理现象均有涉及，因此了解MSCs迁移的迁移机制对开阔MSCs应用新领域有着重要的意义。FSCN1编码的fascin-1蛋白，通常与F-actin蛋白交联，以便来调节细胞膜表丝状伪足、片状伪足和微棘的形成。而这些伪足与微棘等结构对细胞的运动、侵袭、转移等紧密相关，这提示我们FSCN1可能与MSCs细胞的迁移相关。本研究通过干扰五指山小型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)内FSCN1蛋白的表达，造成基因沉默，旨在进一步探讨FSCN1在骨髓间充质干细胞迁移方面的作用。
　　本实验通过设计合成4个针对FSCN1基因的特异性短发卡结构RNA(shRNA)干扰序列并连接载体，采用脂质体介导方式转入细胞，使用荧光定量PCR检测不同shRNA的干扰效果，选出干扰效果最强的一条shRNA。将该shRNA载体进行酶切线性化后，采用电穿孔介导，转入五指山小型猪骨髓间充质干细胞中，并使用G418选择性除去未能成功转染的细胞，从而筛选得到稳定干扰FSCN1表达的细胞系。通过荧光定量PCR、westernblot等技术分别从mRNA水平和蛋白水平对稳定转染细胞中FSCN1的干扰效果进行检测。结果表明筛选得到的转入shRNA的细胞系中FSCN1在mRNA和蛋白水平的表达都得到了有效降低。后分别使用划痕愈合法和transwell穿膜法检测干扰细胞系与对照组细胞系迁移能力的差异。结果一致表明，FSCN1基因沉默后，骨髓间充质干细胞的迁移能力明显降低。这说明FSCN1基因与五指山小型猪骨髓间充质干细胞的迁移能力存在正相关关系。
　　本实验筛选出了FSCN1的有效干扰shRNA，通过实验得到了FSCN1稳定干扰细胞系和对照组细胞系，并通过划痕愈合和transwell方法对其迁移能力进行了检测。这不仅验证了Fascin的骨架功能，也为FSCN1的后期研究工作奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 文献综述

1．1 五指山小型猪简介

1．2 间充质干细胞研究

1．2．1 MSCs简介

1．2．2 BMMSCs应用

1．3 Fascin研究进展

1．3．1 Fascin结构与编码基因

1．3．2 Fascin生理功能

1．4 细胞迁移概述

1．4．1 细胞迁移特点和迁移原理

1．4．2 细胞迁移应用

1．5 shRNA简述

1．6 研究目的和意义

第二章 最优FSCN1干扰shRNA的筛选

2．1 实验材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要仪器和设备

2．1．3 主要试剂和耗材

2．2 实验方法

2．2．1 主要溶液的配制

2．2．2 五指山小型猪骨髓间充质干细胞的复苏

2．2．3 五指山小型猪骨髓间充质干细胞的传代培养

2．2．4 shRNA表达载体的扩增及质粒提取

2．2．5 细胞的转染

2．2．6 转染后细胞总RNA的提取

2．2．7 转染后RNA的反转录

2．2．8 不同shRNA对细胞中FSCN1基因干扰效果的定量检测

2．3 实验结果与分析

2．3．1 最优FSCN1干扰shRNA筛选定量结果

2．3．2 最优FSCN1干扰shRNA筛选定量结果分析

2．4 讨论

第三章 稳定干扰Fascin蛋白表达细胞系的筛选

3．1 实验材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要仪器和设备

3．1．3 主要试剂和耗材

3．2 实验方法

3．2．1 主要溶液的配制

3．2．2 线性化载体的制备

3．2．3 最佳G418浓度的测定

3．2．4 五指山小型猪骨髓间充质干细胞的电穿孔转染

3．2．5 稳定干扰细胞系的筛选

3．2．6 稳定转染细胞系筛选的鉴定

3．2．7 稳定转染细胞系的扩增

3．3 实验结果与分析

3．3．1 线性化载体电泳结果

3．3．2 线性化载体电泳结果分析

3．3．3 稳定转染细胞筛选结果

3．3．4 稳定转染细胞筛选结果分析

3．4 讨论

第四章 稳定干扰Fascin1细胞系的鉴定

4．1 实验材料

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要仪器和设备

4．1．3 主要试剂和耗材

4．2 实验方法

4．2．1 稳定干扰细胞荧光定量PCR检测

4．2．2 稳定干扰细胞蛋白免疫印迹(western blot)检测

4．3 实验结果与分析

4．3．1 稳转细胞系FSCN1表达量的定量PCR检测结果

4．3．2 定量PCR结果分析

4．3．3 稳转细胞系蛋白浓度测定结果

4．3．4 稳转细胞系FSCN1蛋白质印迹结果

4．3．5 蛋白质印迹结果分析

4．4 讨论

第五章 FSCN1有效干扰后细胞迁移能力变化的检测

5．1 实验材料

5．1．1 实验材料

5．2 实验方法

5．2．1 划痕检测细胞迁移能力

5．2．2 Transwell实验测定细胞迁移能力

5．3 实验结果与分析

5．3．1 最优丝裂霉素C使用浓度

5．3．2 特异转染组与非特异转染组划痕愈合实验结果

5．3．3 特异转染组与非特异转染组划痕愈合实验结果分析

5．3．4 特异转染组与非特异转染组transwell实验结果

5．3．5 特异转染组与非特异转染组transwell实验结果分析

5．4 讨论

第六章 小结

6．1 本研究的主要结论和创新

6．2 下一步研究计划

参考文献

致谢

作者简介

攻读硕士学位期间发表的论文