甘蔗茎杆特异表达基因启动子的克隆及其植物表达载体的构建

摘要

组成型启动子如CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子和Ubiquitin(泛素)启动子，在转基因植物的研究中得到了广泛运用。由于组成型启动子不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，在作物的遗传改良中存在一定的缺陷。组织特异启动子作为一类专一性启动子，能指导外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达，它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物营养的浪费。因此，寻找专一性启动子，使外源基因特异、高效的表达已成为植物基因工程的关键环节。 本研究利用GenomeWalking方法从甘蔗主栽品种新台糖22号的叶片基因组DNA中克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a5'端1968bp的调控序列(pPST2a)，测序结果利用启动子分析软件：http://www.fruitflv.org/seqtools/promoter.htm进行在线分析。预测其基础启动子存在于540～590bp、908～958bp、1575～1625bp、1652～1702bp和1894～1944bp处。P1antCare软件(http://oberon.fvms.ugent.be:8080/PlantCARE/)在线分析pPST2a启动子中含有的顺式作用元件。结果表明，1968bp的调控序列中除具有TATA-motif，CAAT-motif典型的真核生物顺式调控元件外，还含有AC-Ⅲ、ERE、GATA-BOX、ABRE等重要的顺式调控元件及一些与光反应相关的元件。 通过PCR方法对pPST2a序列的5'端进行不同长度的缺失，并构建这些缺失片段驱动GUS报告基因表达的植物表达载体pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300、pCBI1100、pCBI700、pCBI500，用基因枪法分别以这些缺失表达载体转化甘蔗叶片和茎杆并进行GUS组织化学检测。检测结果为：经pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300、pCBI1100、pCBI700、pCBI500转化的叶片都没有明显蓝色斑点；而用pCBI1900、pCBI1600、pCBI1300、pCBI1100转化的茎杆呈现出不同程度的蓝色反应，尤以pCBI1900的显色最强，但pCBI700、pCBI500转化的茎杆没有明显的蓝色反应；用p1301转化的叶片和茎杆均可见蓝色斑点；用ddH2O转化的叶片和茎杆均未见蓝色斑点。这些结果说明pPST2a启动子的四个较大的片段都具有启动功能，最长的片段启动活性最强，且它们主要在甘蔗的茎杆中表达，即该启动子具有甘蔗茎杆特异表达的特性。 再用pPST2a启动子构建了1-SST基因的植物表达载体，这为利用甘蔗作为生物反应器生产果聚糖的研究打下良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

1前言

1.1甘蔗概况

1.2甘蔗的作用

1.2.1重要的糖料作物

1.2.2生产酒精

1.2.3其他用途

1.3甘蔗作为生物反应器的研究

1.4甘蔗的启动子的研究

1.4.1必要性

1.4.2甘蔗的启动子的研究

1.5启动子研究进展

1.5.1启动子性质

1.5.2植物基因启动子研究进展

1.5.3启动子顺式作用元件数据库预测和分析

1.6报告基因研究进展

1.6.1新霉素转移酶(NPT-Ⅱ)

1.6.2 GUS

1.6.3绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)

1.6.4荧光素酶

1.7本项目的目的和意义

1.8技术路线

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3酶与生化试剂

2.1.4主要仪器设备

2.1.5 PCR引物

2.2常用溶液及培养基配制

2.2.1培养基配制(王关林等，2002;刘进元等，2003)

2.2.2溶液配制

2.3实验所用试剂配制

2.3.1总DNA提取

2.3.2质粒DNA提取

2.3.3 GUS组织化学染色分析

2.4实验方法

2.4.1 PST2a基因启动子的克隆

2.4.2 PST2a基因启动子系列缺失及缺失表达载体的构建

2.4.3基因枪转化甘蔗组织瞬时表达的研究

2.4.4 pPST2a驱动1-SST植物表达载体的构建

2.4.5 pCBIPS导入农杆菌

3结果与分析

4讨论

4.1关于甘蔗己糖转运蛋白及其基因

4.2关于启动子的克隆与功能鉴定

4.3关于序列的生物信息学分析

4.4关于GUS组织化学染色分析

4.5关于载体的构建策略

4.5.1关于缺失载体策略

4.5.2表达载体的构建

5结论

参考文献

致谢