糖基化终末产物介导牙周膜干细胞增殖及骨向分化过程中的Wnt经典信号通路研究

摘要

目的：糖基化终末产物(AGEs)与糖尿病多种并发症的发生密切相关，近年来，许多研究表明晚期AGEs的积聚参与了促进糖尿病和牙周炎的发生、发展。而牙周膜干细胞(PDLSCs)具有自我更新和多向分化潜能，在维持牙周结构稳态方面起着重要的作用，其功能数量的变化会导致牙周膜的破坏。AGEs是否通过影响牙周膜干细胞的增殖及分化，来促进牙周炎的发展进程呢?同时，AGEs是通过什么信号途径影响牙周膜干细胞的增殖及分化呢?迄今均不清楚。本实验旨在研究AGEs介导的牙周膜干细胞在增殖及骨向分化过程中的改变及其中Wnt经典通路中主要相关因子的变化与PDLSCs增殖和分化改变的相关性。
　　 方法：本实验主要采用体外组织块法培养正常的牙周膜细胞，通过有限稀释法克隆化培养，流式细胞仪进行干细胞表型分子鉴定，得到正常的PDLSCs。以两组细胞(健康组N-PDLSCs组和AGEs刺激组A-PDLSCs组)作为实验对象：①计算其克隆形成率；②MTT法检测细胞增殖；③实时定量聚合酶链反应(real time PCR、RT-PCR)检测Wnt经典通路中DKK-1(Wnt通路的抑制剂)、β-catenin；④Western Blot检测细胞核蛋白中β-catenin的表达。以及对两组细胞加入成骨诱导液进行成骨诱导，诱导7天进行ALP染色；诱导21天茜素红染色观察钙化结节的形成情况；RT-PCR检测诱导7天后的成骨基因ALP、BSP、RUNX-2的表达及Wnt经典通路中β-catenin、DKK-1的表达；Western Blot检测进一步验证加入成骨诱导后的成骨蛋白表达和细胞核中蛋白β-catenin的表达；N-PDLSCs组成骨诱导过程中加入Wnt通路激活剂LICL，检测其中相关的成骨能力；最后在A-PDLSCs组成骨诱导过程中加入Wnt通路激活剂LICL及抑制剂DKK-1检测成骨基因ALP、BSP、RUNX-2的表达状况。
　　 结果：1.牙周膜干细胞分离纯化及初步鉴定：有限稀释法筛选的PDLSCs形态间无明显差异，均呈长梭形，胞体丰满。经过流式细胞技术检测CD146、STRO-1、CD105、CD29等表型分子，检测结果均为阳性，阳性率分别为：38.8％、16.8％、95.0％、99.7％，从而明确了该干细胞的特性。
　　 2.克隆形成率及MTT比较：与N-PDLSCs组相比，A-PDLSCs组的克隆形成率较低，两组细胞的克隆形成率分别为25.3±1.6％、17.2±2.1％，两组差异有统计学意义(P<0.05)；MTT法连续七天对两组细胞增殖情况显示，与N-PDLSCs组相比，A-PDLSCs的细胞增殖明显减慢，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 3.成骨诱导后成骨能力的比较：成骨诱导两组细胞7天后，ALP染色在A-PDLSCs组明显浅于N-PDLSCs组，诱导21天茜素红染色结果显示A-PDLSCs组诱导后钙化结节少于N-PDLSCs组；另外，诱导7天后RT-PCR检测发现A-PDLSCs组成骨基因BSP、ALP、Runx-2的表达都较低，差异有统计学意义(P<0.05)，同时Western Blot的结果与RT-PCR的结果相一致。
　　 4.增殖和骨向分化过程中Wnt经典通路中相关因子的比较：在增殖过程中对Wnt经典通路基因β-catenin、DKK-1进行RT-PCR检测，β-catenin在A-PDLSCs组表达低于N-PDLSCs组，而DKK-1在A-PDLSCs组表达明显高于N-PDLSCs组，差异有统计学意义(P<0.05)，Weston Blot结果也显示A-PDLSCs组核蛋白中的β-catenin表达明显低于N-PDLSCs组，这与RT-PCR结果相符；成骨诱导一周后，RT-PCR检测结果显示：总的β-catenin在A-PDLSCs组表达高于N-PDLSCs组，DKK-1在A-PDLSCs组表达明显低于N-PDLSCs组，并且Weston Blot显示核蛋白β-catenin的表达在A-PDLSCs组高于N-PDLSCs组。
　　 5.正常细胞成骨诱导过程中加入Wnt通路激活剂LICL、抑制剂DKK-1后成骨基因表达的变化：N-PDLSCs组加入LICL刺激后成骨基因BSP、ALP、Runx-2表达都有不同程度的下调。A-PDLSCs组在LICL刺激后成骨基因的表达都比未加LICL刺激组表达低，而在加抑制剂的DKK-1组，其成骨能力与单独的N-PDLSCs组相比，无明显统计学意义。
　　 结论：依据实验结果，在AGEs的作用下：PDLSCs增殖过程中Wnt经典通路被抑制，其增殖能力下调；而在PDLSCs骨向分化阶段，Wnt经典通路可被激活，成骨能力下降。我们推测糖基化终末产物刺激下的牙周膜干细胞中的Wnt经典信号通路产生了改变，导致牙周膜干细胞的增殖及分化能力的变化。