丹酚酸A、B及其分子药对配伍对肾纤维化过程中PDGF-C/PDGFR-α信号途径的干预作用

摘要

目的:观察丹酚酸A、B及其分子药对配伍对肾纤维化中PDGF-C/PDGFR-α信号通路的干预作用,建立分子药对配伍的新模式,为应用中医理论研究中药分子药对走向临床提供新的思路。
　　方法:50只雄性SPF级SD大鼠随机分为五组:正常组(n=10)、造模组(n=40)。造模组采用单侧输尿管梗阻(UUO)建立肾间质纤维化模型,造模后分为模型组(n=10),丹酚酸A组(n=10),丹酚酸B组(n=10),丹酚酸A、B按1:1配伍组(简称丹酚酸A+B组,n=10)。于造模后第2天开始,各组给予相应的干预措施治疗14天,实验结束前1天收集24小时尿液,治疗期满后麻醉大鼠,腹主动脉采血,摘取右侧肾组织并沿纵轴剖开,一半用4％的多聚甲醛固定,一半放置液氮保存。检测大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿NAG蛋白、β2微球蛋白(β2-MG),观察肾组织病理改变及胶原沉积,并应用免疫荧光观察大鼠肾组织CTGF、Par-3蛋白表达情况,Western Blot方法检测大鼠肾组织PDGFC、PDGFR-α蛋白的表达变化,RT-PCR法检测大鼠肾组织PDGFC、PDGFR-αmRNA表达变化。
　　结果:1.HE染色结果正常组大鼠肾组织未见病理改变,UUO组大鼠肾组织可见肾小管上皮细胞大量萎缩空泡变性,管腔扩张或断裂,并可见肾间质内大量炎性细胞浸润,间质纤维化较明显;各治疗组病理变化较模型组均有明显改善,丹酚酸B、A+B组HE评分均显著低于丹酚酸A剂量组(P<0.05)。
　　2.Masson染色结果正常组大鼠肾组织胶原沉积不明显,模型组可见肾小囊、肾小管基膜及间质出现明显的丝状淡蓝色胶原沉积,各治疗组大鼠肾组织胶原沉积较模型组均明显减轻。各治疗组间比较,丹酚酸A+B剂量组Masson评分显著低于丹酚酸A剂量组(P<0.05)。
　　3.肾功能测定结果与正常组比较,模型组大鼠血清Cr,BUN水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,丹酚酸A组可明显降低大鼠血清Cr水平(P<0.05),余治疗组大鼠血清Cr水平有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);较之模型组,丹酚酸A组和丹酚酸B组可明显降低大鼠血清BUN水平(P<0.05),余治疗组大鼠血清BUN水平有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);各治疗组间比较,大鼠血清Cr和BUN水平差异无统计学意义(P>0.05)。
　　4.尿β2微球蛋白检测结果与正常组比较,模型组大鼠尿?2-MG水平显著升高(P<0.05),与模型组比较,各治疗组大鼠尿?2-MG水平显著降低(P<0.05),各治疗组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　5.尿NAG蛋白检测结果与正常组比较,模型组大鼠尿NAG蛋白水平显著升高(P<0.05),与模型组比较,各治疗组大鼠尿NAG水平显著降低(P<0.05),各治疗组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
　　6.CTGF免疫荧光检测结果 CTGF阳性表达信号呈绿色,表达部位主要定位于UUO大鼠肾组织肾小管上皮细胞。正常组大鼠肾组织肾小管上皮细胞多呈阴性,荧光强度较弱(±);模型组大鼠肾组织肾小管上皮细胞阳性细胞数目比正常组明显增多,荧光强度明显增强(+++);经丹酚酸A、B及组分配伍治疗后,CTGF荧光强度较模型组明显减弱,其中以丹酚酸A+B组减弱较为明显(±),丹酚酸B组次之(+),丹酚酸A组较模型组荧光略有减弱(++)。
　　7.Par-3免疫荧光检测结果 Par-3阳性表达信号呈绿色,表达部位主要定位于大鼠肾组织肾小管上皮细胞胞质。正常组大鼠肾组织肾小管上皮细胞多呈阳性,荧光强度较强(+++);模型组大鼠肾组织肾小管上皮细胞阳性细胞数目比正常组明显减少,荧光强度明显减弱(±);经丹酚酸A、B及组分配伍治疗后,丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸A+B组Par-3荧光强度较模型组明显增强,其中以丹酚酸A+B组增强较为明显(+++),丹酚酸B组次之(++),丹酚酸A组荧光略有增强(+)。8.RT-PCR检测结果与正常组比较,模型组大鼠肾组织 PDGF-CmRNA和PDGFR-αmRNA相对表达显著升高(P<0.05);较之模型组,各治疗组大鼠肾组织PDGF-CmRNA和PDGFR-αmRNA相对表达显著降低(P<0.05),各治疗组间比较,丹酚酸A+B组能显著降低大鼠肾组织PDGF-CmRNA相对表达,其效果优于丹酚酸A组,差异具有统计学意义(P<0.05),丹酚酸 A+B组能显著降低大鼠肾组织PDGFR-αmRNA相对表达,其效果优于丹酚酸A组和丹酚酸B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。
　　9. Western blot检测结果与正常组比较,模型组大鼠肾组织PDGF-C和PDGFR-α蛋白相对表达显著升高(P<0.05);与模型组比较,各治疗组大鼠肾组织 PDGF-C和PDGFR-α蛋白相对表达显著降低(P<0.05),各治疗组间比较,丹酚酸A+B组大鼠肾组织PDGF-C蛋白相对表达显著低于丹酚酸A组和丹酚酸B组(P<0.05)。
　　结论:1.丹酚酸B和组分配伍组能显著改善大鼠肾组织病理改变,其效果优于丹酚酸A组;组分配伍组能显著减轻大鼠肾组织胶原沉积,其效果优于丹酚酸A组;组分配伍组能显著抑制大鼠肾组织CTGF的表达,促进大鼠肾组织Par-3的表达,其效果优于丹酚酸A和B组;组分配伍组能显著降低大鼠肾组织PDGF-CmRNA的相对表达,其效果优于丹酚酸A组;组分配伍组能显著降低大鼠肾组织PDGFR-αmRNA和PDGF-C蛋白的相对表达,其效果优于丹酚酸A和B组;而丹酚酸A、B及其分子药对配伍在改善大鼠肾功能和肾小管功能方面无显著差异。
　　2.丹酚酸A、B及其分子药对配伍能一定程度改善UUO大鼠肾功能、肾小管功能及肾脏病理,对 UUO大鼠肾脏具有一定的保护作用,其机制可能与其促进 Par-3在UUO大鼠肾组织中的表达、减少CTGF的表达,有效降低PDGF-C和PDGFR-α在肾组织中蛋白及基因的表达,干预肾纤维化PDGF-C/PDGFR-α信号通路有关,体现了中药多途径、多靶点、多成分的综合效应。

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前言

1材料与方法

1.1 实验动物

1.2 实验药物

1.3 主要试剂及来源

1.4 主要实验仪器

1.5 主要常规试剂配制

2 方法

2.1 技术路线

2.2有效组分溶液的制备：

2.3动物分组

2.4动物给药

2.5单侧输尿管梗阻模型制备

2.6观测指标检测方法及分析

2.7 实时荧光定量PCR检测PDGF-C、PDGFR-αmRNA表达

3. 统计学处理

4. 结果

4.1肾脏组织病理评分结果

4.2丹酚酸A、B及其分子配伍对UUO大鼠肾功能的影响

4.3 丹酚酸A、B及其分子配伍对UUO大鼠肾小管功能的影响

4.4丹酚酸A、B及其分子配伍对UUO大鼠肾组织CTGF、Par-3表达

4.5 real-time PCR检测PDGF-CmRNA、PDGFR-αmRNA的表达

4.6丹酚酸A、B及其分子配伍对UUO大鼠肾组织PDGF-C、PDGFR-α蛋白表达影响

5.讨论

5.1丹酚酸A、B及其分子药对配伍对UUO大鼠肾组织的保护作用

5.2丹酚酸A、B及其分子药对配伍对UUO大鼠?2-MG、NAG的影响

5.3丹酚酸A、B及其分子药对配伍对UUO大鼠CTGF的影响

5.4丹酚酸A、B及其分子药对配伍对UUO大鼠Par-3的影响

5.5丹酚酸A、B及其分子药对配伍对UUO大鼠PDGF-C/PDGFR-α信号通路的影响

5.6本实验进一步研究方向

6.结论

参考文献

PDGF及PDGFR在肾间质纤维化中的研究进展

致谢

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