酵母双杂交系统筛选与禽流感病毒NS1相互作用的宿主因子

摘要

禽流感病毒非结构蛋白1(NS1蛋白)全长约为230个氨基酸，理论分子量约为26KDa，主要包括两个功能结构域，即N-末端的RNA结合结构域和和C-末端的效应结构域。NS1蛋白是一个多功能的病毒蛋白，它不仅影响着该病毒其他基因的表达，更能通过与宿主多种细胞因子的相互作用干预宿主细胞的正常功能，抵抗宿主的抗病毒系统。NS1蛋白因此被认为是禽流感病毒的一个重要毒力因子。为了寻找与NS1相互作用的其它宿主蛋白以及试图探索NS1的新功能，最终阐明禽流感的致病性机制，我们利用酵母双杂交系统，以NS1为诱饵蛋白，从人胸腺cDNA文库中筛到了8个宿主因子可与NS1蛋白相互作用，我们选择U蛋白作为我们研究的目的蛋白，并作了点对点酵母双杂交回转实验。结果发现两者确实是互作的，并且互作的部位位于NS1蛋白的RNA结合结构域上。同时我们利用GST Pull-down进一步验证了二者的相互作用。在研究当中还发现，高致病性禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的80-84位氨基酸缺失可能对禽流感的致病性很重要，这提示针对H5N1型高致病性禽流感病毒可能是一个新的药物靶点。

目录

声明

引言

1研究的目的和意义

2主要研究内容

3研究技术路线

第一章论文综述

1.1禽流感病毒研究进展

1.1.1禽流感病毒的形态和化学成分

1.1.2禽流感病毒的分子结构与分类

1.1.3禽流感病毒的复制与致病机理

1.1.4存在问题与展望

1.2 NS1蛋白的结构

1.2.1N-末端RNA结合区的结构

1.2.2C-末端效应区的结构

1.3 NS1蛋白的功能

1.3.1抑制和利用宿主细胞的转录翻译系统

1.3.2拮抗干扰素的抗病毒作用

1.3.3 NS1蛋白下调细胞凋亡

1.4 NS1蛋白与其他宿主蛋白相互作用

1.4.1 NS1蛋白和importina/β相互作用

1.4.2 NS1蛋白和nucleolin相互作用

1.5酵母双杂交系统

1.5.1酵母双杂交系统的作用原理

1.5.2酵母双杂交系统选用酵母作为报告株的优点

1.5.3酵母双杂交系统相对其他方法具有的优点

1.5.4酵母双杂交系统中常见的问题

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株及细胞系

2.1.2质粒载体

2.1.3引物

2.1.4酶类、分子量标准与试剂盒

2.1.5主要化学试剂及常规溶液的配制

2.1.6培养基

2.1.7主要仪器

2.2方法

2.2.1 PCR扩增

2.2.2 DNA片段的回收(DNA片段凝胶回收试剂盒)

2.2.3限制性内切酶酶切反应

2.2.4酶切DNA片段与酶切载体的连接

2.2.5感受态细胞的制备(RbCl法)

2.2.6 RbCl感受态细胞的转化

2.2.7质粒快速抽提(质粒小量纯化试剂盒)

2.2.8酵母感受态的制备与转化

2.2.9酵母蛋白的提取

2.2.10酵母质粒的提取

2.2.11酵母转化子β-半乳糖苷酶的固体测活

2.2.12细胞培养及转染

2.2.13 Western Blotting

2.2.14融合蛋白的原核表达与纯化

2.2.15 GST Pull Down分析

第三章实验结果

3.1 pGBKT7-NS1重组质粒的构建

3.1.1 PCR扩增禽流感病毒NS1基因

3.1.2 pGBKT7-NS1酵母表达载体的构建

3.2酵母双杂交系统筛选与NS1相互作用的宿主蛋白

3.2.1 pGBKT7-NS1在酵母AH109中蛋白表达的检测

3.2.2 pGBKT7-NS1自激活活性的检测

3.2.3 cDNA文库转化酵母AH109

3.2.4阳性克隆的筛选

3.2.5提取酵母质粒进行PCR扩增并转化大肠杆菌

3.2.6测序结果与分析

3.2.7回交验证

3.2.8Mapping文库蛋白U的结合部位

3.3 GST Pull-down验证NS1蛋白与文库蛋白的相互作用

3.3.1 PCR扩增文库蛋白基因

3.3.2pGEX4T1-U原核表达载体的构建

3.3.3 U蛋白在原核细胞中的表达

3.3.4GST Pull-down实验

第四章讨论

4.1酵母双杂交系统

4.2蛋白相互作用的鉴定

4.3 NS1蛋白功能提示

参考文献

硕士期间发表文章

致谢

附录 缩略词表