牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌共培养物的多样性及其纤维降解特性研究

摘要

青藏高原牦牛终年以放牧方式生活在海拔3000米以上的极端生态环境，栖息在瘤胃中的大量微生物使牦牛瘤胃成为高效降解木质纤维素的天然发酵罐。其中，厌氧真菌是一种重要的木质纤维素降解微生物。有研究认为，与瘤胃真菌共生的一些甲烷菌能够提高厌氧真菌纤维素降解活性，并促进木质纤维素降解代谢转化生成乙酸和甲烷。目前有关瘤胃厌氧真菌和甲烷菌之间的自然共存关系研究报道很少，为开发利用瘤胃内高效降解木质纤维素的优质真菌资源，本文首次以甘肃省天祝放牧牦牛为研究对象，利用亨氏厌氧滚管培养技术，分离获得了大量瘤胃厌氧真菌及甲烷菌自然共培养物，分析探讨了厌氧真菌和甲烷菌之间的自然共存关系，并开展了这些共培养物对农作物秸秆的木质纤维素降解功效和消化代谢研究，主要研究结果如下：
　　1.牦牛瘤胃共培养物的多样性：自天祝全放牧牦牛瘤胃食糜液中分离获得生长稳定的厌氧真菌及甲烷菌共培养物20个，通过形态学结合ITS1序列分析鉴定厌氧真菌的种属，通过PCR-DGGE技术和16SrDNA序列分析与厌氧真菌共生的甲烷菌的多样性和种类。20个共培养物包括4种组合类型：8个Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter ruminantium，1个Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter millerae，8个 Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium，3个Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium。
　　2.高效共培养物的筛选：以小麦秸秆为生长底物，通过检测产气量、多糖水解酶活性、酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量，研究发现8个共培养Neocallimastix frontalis+Methanobrevibacter ruminantium和3个共培养 Piromyces+Methanobrevibacter ruminantium比9个共培养 Orpinomyces joyonii+Methanobrevibacter ruminantium生长更加稳定快速，表现出更强的秸秆纤维降解活性。自20个3属真菌与甲烷菌共培养中，筛选出降解秸秆的3个高效共培养物分别为：O. joyonii Yak7+M. ruminantium。N. frontalis Yak16+M. ruminantium和Piromyces Yak18+M. ruminantium。
　　3．高效共培养和相应的真菌纯培养对秸秆的降解能力比较：在上述2研究的基础上，以小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆为底物，在7天培养期内，3个高效共培养物中N. frontalis Yak16+M. ruminantium表现出最强的降解秸秆木质纤维素功能，产生最高活性木聚糖酶、滤纸纤维素酶、阿魏酸酯酶、乙酰酯酶、香豆酸酯酶、最高干物质降解率、中性和酸性洗涤纤维降解率和最多的酚酸释放量。甲烷菌M. ruminantium在不同程度上提高了3株厌氧真菌纯培养降解秸秆的功能，尤其是真菌纯培养N. frontalis Yak16本身以3种秸秆为底物具有较高干物质降解率，而与甲烷菌M. ruminantium形成自然共培养后进一步显著提高了真菌纯培养N. frontalis Yak16的降解功能，使共培养物N. frontalis Yak16+M. ruminantium成为高效降解秸秆木质素纤维素的最佳优势组合，最高值分别达到：以麦秸为底物木聚糖酶12500 mU，以玉米秸为底物滤纸酶430.3 mU，阿魏酸酯酶11.0 mU，乙酰酯酶199.3 mU，香豆酸酯酶5.0 mU，中性洗涤纤维降解率61.7％，酸性洗涤纤维降解率55.7%，阿魏酸释放24.1 ug/mL和p-香豆酸释放50.3μg/mL，以稻秸为底物的干物质降解率71.9%。
　　4.高效共培养物和相应的真菌纯培养降解秸秆所产代谢产物比较：在上述3研究的基础上，以小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆为底物，在7天培养期内，3个高效共培养物相对应的3个纯培养真菌产生乙酸、乳酸、乙醇和氢气产量依次是N. frontalis Yak16﹥Piromyces Yak18﹥O. joyonii Yak7，尤其是厌氧真菌纯培养N. frontalis Yak16产生大量乙醇和乳酸，乙醇产量远高于以前文献报道。3个高效共培养产生乙酸、乳酸和甲烷产量依次是：N. frontalis Yak16+M. ruminantium﹥Piromyces Yak18+M. ruminantium﹥O. joyonii Yak7+M. ruminantium，尤其是共培养N. frontalis Yak16+M. ruminantium产生大量乙酸和甲烷，归因于甲烷菌M. ruminantium改变了厌氧真菌的代谢途径。根据上述结果，无论是厌氧真菌纯培养 N. frontalis Yak16，还是厌氧真菌及甲烷菌共培养 N. frontalis Yak16+M. ruminantium都可能在提高木质纤维素生物降解中具有重要的开发应用价值。
　　综上所述，本文系统揭示了天祝放牧牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌之间的自然共生关系，并通过秸秆纤维降解对比试验阐释了牦牛瘤胃厌氧真菌在纯培养或与甲烷菌共培养条件下对不同作物秸秆的降解能力差异和代谢转化特性，为今后牦牛瘤胃微生物资源的开发利用与提高木质纤维素降解功效提供了理论科学依据。

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主要中英文缩略表

目录

第一章 绪 论

1.1 研究背景

1.2 文献综述

1.3 研究意义

1.4 研究目的与内容

1.5 技术路线

第二章 牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养物的分离和鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 试验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 牦牛瘤胃高效降解秸秆厌氧真菌及甲烷菌共培养的筛选

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 牦牛瘤胃厌氧真菌及产甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆功效研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.3 试验结果

4.4讨论

4.5 小结

第五章 牦牛瘤胃厌氧真菌及甲烷菌共培养和真菌纯培养降解秸秆消化代谢研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

第六章 主要研究结论及展望

6.1 论文总结

6.2 展 望

创 新 点

参考文献

攻读博士期间的科研成果

致谢