妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠胸腺及外周T细胞的影响

摘要

目的：
　　金黄色葡萄球菌肠毒素B（Stap hyloc occa l e nte roto xin B，SEB）既是一种毒素性物质，又是葡萄球菌肠毒素家族9个血清型中最重要和研究较多的超抗原。SEB作为一种超抗原，无需经过抗原递呈细胞的识别和加工，就可以直接通过桥联抗原递呈细胞的MHCⅡ类分子结合槽外侧区与T淋巴细胞TC R的Vβ区，刺激机体免疫系统大量的T细胞活化。通常SEB进入机体后，初期可短暂激活Vβ8+T细胞并诱发大量增殖，继而过度增殖的细胞发生凋亡导致克隆清除，而出现中枢或外周耐受。尽管有许多关于 SEB对成年动物及新生鼠免疫器官、T淋巴细胞及细胞因子影响的研究，但妊娠期母鼠接触 SEB对子代新生鼠细胞免疫的影响，目前国内外未见报道。因此，我们选用妊娠16天孕鼠尾静脉注射15μg SEB，同时建立PBS对照，在子代新生鼠出生后第0-5天检测胸腺、脾脏及外周血中CD4/CD8 T细胞及TCR Vβ8+T细胞亚群；通过新生鼠胸腺体外培养观察 ConA或 SEB刺激后胸腺细胞的分化发育；通过脾脏淋巴细胞体外培养观察其对ConA或S EB刺激的增殖应答情况。
　　方法：
　　1.选用清洁级成年SD大鼠，交配及确定受孕后，孕鼠饲养至妊娠16天随机分组，每组12只，实验组（SEB组）孕鼠通过尾静脉注射15μg的S EB，同时设立对照组，给予等体积的PBS（磷酸盐缓冲液）。
　　2.在妊娠期满（21天）时，用4％水合氯醛麻醉孕鼠后打开腹腔和子宫，取出胎鼠并分离胸腺和脾脏，称量胎体、胎盘、胸腺及脾脏的干湿重。
　　3.在新生鼠出生后的第0-5天，获取每组新生鼠的胸腺、脾脏和外周血，用网搓法制备胸腺及脾脏的单细胞悬液，脾脏的单细胞悬液及外周血用红细胞裂解液去除红细胞。将获得的细胞悬液分为两份，一份用荧光抗体CD3-FITC、CD4-APC和CD8-PE进行细胞染色，另一份用Vβ8.2-FITC、CD4-APC和C D8-PE进行染色，染色后经流式细胞仪检测T细胞亚群的比例。
　　4.无菌分离出生后第0天的两组新生鼠胸腺，采用胸腺器官培养法（thymus organ culture，TOC）进行体外培养，并加入ConA或SEB共培养三天。在培养结束时收集胸腺并制备单细胞悬液，染色后经流式细胞仪检测胸腺中T细胞亚群的比例。
　　5.无菌分离出生后第3天的两组新生鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，体外与ConA或S EB连续共培养三天。在第1、2、3天培养结束时，收集脾脏淋巴细胞，染色后经流式细胞仪检测脾脏中T细胞亚群的比例。若检测脾脏淋巴细胞增殖能力时，在每一时间点结束前5小时加入3H-TDR共培养至结束，然后通过γ计数仪检测rp m.
　　结果：
　　1.妊娠期母鼠接触SEB后对胎鼠体重等指标的影响
　　妊娠期第16天母鼠静脉注射SEB后，可明显减少胎鼠胸腺及脾脏的湿重和干重(P<0.01)；但与PBS组比较，S EB组的胎体及胎盘的干、湿重无统计学差异。
　　2.妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠中枢及外周CD4/CD8 T细胞亚群的影响
　　2.1妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠胸腺中C D4/CD8 T细胞亚群的影响
　　妊娠期第16天母鼠接触SEB后，在新生鼠出生后的第0-5天，SEB组新生鼠胸腺中CD4+T细胞的比例明显高于PBS组(P<0.01或P<0.05)，而SEB组CD8+T细胞的比例明显低于PBS组的(P<0.01或P<0.05)。
　　2.2妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠脾脏中C D4/CD8 T细胞亚群的影响
　　在新生鼠出生后第0-5天，SEB组新生鼠脾脏中CD4+T细胞的比例在各时间点均明显高于PBS组(P<0.01或P<0.05)。但两组在各时间点的CD8+T细胞比例无统计学差异。
　　2.3妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠外周血中C D4/CD8 T细胞亚群的影响
　　在新生鼠出生后第0-5天，PBS组和SEB组新生鼠外周血CD4+T细胞与CD8+T细胞亚群比例的总体变化趋势与脾脏中的相类似。两组外周血中C D4/C D8 T细胞比值均呈上升趋势，从第0-1天的比值小于1逐渐增加到之后的大于1，但SEB组在各时间点的CD4/CD8 T细胞的比值均明显高于PBS组(P<0.01或P<0.05)。
　　3.妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠中枢及外周TC R Vβ8.2+T细胞的影响
　　妊娠期第16天母鼠接触SEB后，在新生鼠出生后的第0-3天，SEB组新生鼠胸腺中的CD4+TCR Vβ8.2+ T细胞比例较PBS组的明显减少(P<0.01或P<0.05)，在第4-5天两组的CD4+TCR Vβ8.2+ T细胞比例趋于平稳，且无统计学差异；而在出生后的第0-5天，SEB组新生鼠胸腺及外周血中CD8+TCR Vβ8.2+T细胞比例及外周血中的CD4+TCR Vβ8.2+T细胞比例均较PBS组的明显减少(P<0.01或P<0.05)。
　　4.妊娠期母鼠接触SEB对体外培养新生鼠胸腺分化发育的影响
　　4.1妊娠期母鼠接触SEB对体外培养新生鼠胸腺中CD4/CD8 T细胞亚群的影响
　　PBS组和SEB组新生鼠胸腺体外与Co nA或S EB共培养三天后，SEB组新生鼠胸腺中CD4+T细胞及CD8+T细胞的比例在Co nA（S EB+Co nA组）或S EB（S EB+S EB组）刺激后均较PBS组（PBS+Co nA组；PBS+S EB组）的明显减少(P<0.01或P<0.05)；而SEB组CD4+CD8+T细胞的比例较P BS组明显增加(P<0.01或P<0.05)，但胸腺中CD4-CD8-T细胞的比例在两组间无统计学差异。
　　4.2妊娠期母鼠接触SEB对体外培养新生鼠胸腺中TC R Vβ8.2+T细胞的影响
　　PBS组和SEB组新生鼠胸腺体外与Co nA或S EB共培养三天后，SEB组的CD4+TCR Vβ8.2+T细胞和CD8+TC R Vβ8.2+T细胞比例均较P BS组明显减少(P<0.01或P<0.05)。
　　5.妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响
　　5.1妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠脾脏T淋巴细胞亚群增殖的影响
　　PBS组和S EB组新生鼠脾脏淋巴细胞体外与ConA或S EB共培养三天后，SEB组CD4+T细胞比例在Co nA或SEB刺激第一天分别较PBS组明显增加，但在第2-3天却明显降低(P<0.01或P<0.05)，但两组的CD8+T细胞比例无统计学差异。而SEB组新生鼠脾脏淋巴细胞中CD4+TCR Vβ8.2+T细胞比例在ConA或S EB刺激的第1天及CD8+TCR Vβ8.2+ T细胞比例在连续刺激三天分别较P BS组的明显增加(P<0.01或P<0.05)，但两组CD4+TC R Vβ8.2+T细胞比例在Co nA或S EB刺激的第2-3天无差异性。
　　5.2妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠脾脏淋巴细胞增殖指数的影响
　　PBS组和SEB组新生鼠脾脏淋巴细胞体外与ConA或SEB共培养三天后，3H掺入法检测结果发现SEB组新生鼠脾脏淋巴细胞在Co nA或S EB刺激后第1天增殖能力明显强于PBS组，但在第2-3天的增殖能力却又明显低于P BS组(P<0.01或P<0.05)。
　　结论：
　　1.妊娠期母鼠接触SEB可明显影响胎鼠胸腺及脾脏的发育；
　　2.妊娠期母鼠接触 S EB可通过中枢和外周两种克隆清除方式导致新生鼠 TCRVβ8.2+T细胞比例减少，但S EB并非仅仅作用于TC R Vβ8.2+T细胞，可能对其它的T淋巴细胞也产生影响；
　　3.在受到抗原刺激时，妊娠期母鼠接触 SEB并不影响新生鼠胸腺中 DN细胞向 DP细胞的发育过程，但明显减少DP细胞向SP细胞的成熟过程；
　　4. CD4+T细胞可能是妊娠期接触SEB母鼠的新生鼠脾脏淋巴细胞增殖的主要细胞群体；
　　5.妊娠期母鼠接触SEB已在新生儿期对新生鼠CD4+T细胞、CD8+T细胞以及 TCR Vβ8.2+T细胞形成印迹效应，可能成为胎源性疾病的起源。

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中文摘要

英文摘要

引言

材料与方法

1、实验材料

2、实验方法

实验结果

1 妊娠期母鼠接触SEB后对胎鼠体重等指标的影响

2 妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠中枢及外周CD4/CD8 T细胞亚群的影响

3 妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠中枢及外周Vβ8.2+T细胞的影响

4 妊娠期母鼠接触SEB对体外培养的新生鼠胸腺分化发育的影响

5 妊娠期母鼠接触SEB对新生鼠脾细胞体外增殖的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A英文缩略词表

附录B常用试剂配置

附录C：个人简历

附录D：发表及待发表的论文

附录E 综述： 葡萄球菌肠毒素B与免疫系统及免疫性疾病的关系