大肠杆菌EF-Tu多蛋白复合体的研究

摘要

细菌延伸因子Tu(elongation factor Tu，EF-Tu)是一种高丰度蛋白，在蛋白质生物合成的延伸过程中起到了关键性的作用。近年来，EF-Tu却是作为一种新发现的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)分子而受到高度重视。作为一个具有高度保守性的菌细胞内的蛋白质，它是如何从细胞内跨膜运动到细胞外，并且被宿主细胞特异性地识别进而引发宿主的免疫反应的。同时，在此过程中又有哪些膜蛋白起了重要的作用。这无疑具有着相当重要的生物学意义。 试验首先采用Ni-NTA柱纯化和生物质谱技术，以模式大肠杆菌为试验材料，发现了内膜蛋白MdtE、外膜蛋白OmpF和具有4个跨膜片段的外膜蛋白OmpA与浆蛋白EF-Tu之间存在着蛋白质相互作用，形成了1个多蛋白复合体，被命名为EF-Tu多蛋白复合体。同时采用Western blotting、Far-Western blotting和免疫共沉淀等技术，充分证实了上述结论。并提出了该多蛋白质复合体的分子结构模型。在此基础上，研究这4种蛋白在胞浆中的结合情况。结果发现，他们以EF-Tu·OmpA，OmpF·OmpA和MdtE·OmpA 3种两两结合的形式存在。进一步探讨该复合体在细胞分泌性蛋白中的状态，发现该多蛋白质复合体缺少了MdtE，而以EF-Tu、OmpA和OmpF蛋白复合体形式分泌至胞外。最后，对EF-Tu多蛋白复合体与人单核/巨噬细胞结合情况进行了研究，发现EF-Tu、OmpA和OmpF仍然以一个多蛋白复合体的形式和细胞发生了相互作用，其中EF-Tu和OmpA为直接结合分子。这些结果提示OmpA和OmpF在EF-Tu被宿主细胞识别和引起免疫反应的过程中发挥了重要作用。 上述研究首次发现了EF-Tu多蛋白复合体，揭示了该复合体从胞浆至胞外的形成和运输特征，阐明了其与动物细胞作用形式。这些研究结果对深入阐明EF-Tu病原相关分子模式的生物学功能具有主要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

1.前言

1.1革兰氏阴性病原菌的危害性

1.2病原菌与宿主

1.3外膜蛋白在病原发生中的作用

1.4蛋白质相互作用

1.4.1生物物理学方法

1.4.2分子生物学方法

1.4.3遗传学方法

1.4.4预测蛋白质间相互作用的生物信息学方法

2.材料与方法

2.1材料

2.2试验方法

3.结果

3.1大肠杆菌K12中EF-Tu多蛋白复合物的发现

3.1.1 EF-Tu多蛋白复合物的发现

3.1.2 Western blotting对发现的蛋白复合物的确认

3.1.3 Far-Western blotting对发现的蛋白复合物的进一步证明

3.1.4免疫共沉淀对该蛋白复合物的再次确认

3.2 EF-Tu多蛋白复合物中各蛋白在EFTu跨膜运动中的作用

3.2.1 EF-Tu蛋白复合物中各蛋白在浆蛋白组分中的作用研究

3.2.2 EF-Tu蛋白复合物中各蛋白在膜蛋白组分中的作用研究

3.2.3 EF-Tu蛋白复合物中各蛋白在分泌性蛋白组分中的作用研究

3.3 EF-Tu蛋白复合物与人单核/巨噬细胞作用的研究

3.3.1 EF-Tu多蛋白复合物中各蛋白组分与人单核/巨噬细胞作用的研究

3.3.2不同大肠杆菌菌株分泌性蛋白与人单核/巨噬细胞作用的研究

4.讨论：

5.小结

6.展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文和成果

致谢