不同氮源和2-OG浓度对铜绿微囊藻NirA的表达调控及差异蛋白组分析

摘要

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是富营养化湖泊和水库中形成“水华”的主要藻种。分子生物学技术和蛋白质组学的快速发展为深入研究赤潮、水华形成及其性质提供了重要手段。水华对人类正常生活和环境的影响日益严重，由于水华发生是多方面原因引起的，研究常见赤潮、水华藻种在特定环境中的蛋白质组差异，从中寻找出有价值的差异蛋白质分子，这在理论和实践上对一些赤潮、水华的防治都具有重要意义。 本文运用分子生物学和蛋白质组学技术方法，分析了铜绿微囊藻7806的氮源吸收操纵子结构nirA并成功克隆表达了nird基因；在不同氮源和不同浓度的α—酮戊二酸(2—OG)诱导培养铜绿微囊藻7806，western blot检测了NirA的表达变化并对其进行差异蛋白组分析，探讨了差异蛋白在生物代谢途径中的作用，旨在深入研究铜绿微囊藻的氮代谢机制。 首先，我们分析了铜绿微囊藻7806的氮源吸收相关的nirA操纵子结构，发现nirA和narB基因与nrtABCD分开，该藻并不具有保守的nirA操纵子结构：找到了蓝藻中相对保守的编码亚硝酸还原酶基因，nirA，并成功克隆表达了nirA基因；将表达纯化的NirA对小鼠进行免疫，制备了多克隆抗体以用于检测NirA在藻细胞内的表达变化。 接着，我们分析了不同氮源及不同浓度2—OG对铜绿微囊藻生长和NirA蛋白表达的影响。以BG—11为基础培养基，氮饥饿处理24h后，添加不同氮源(缺氮培养、亚硝酸钠10mM、硝酸钠15mM、硫酸铵3.75mM)对藻株进行诱导处理24h和72h。之后提取藻细胞全蛋白进行western blot分析，结果显示不同氮源对藻细胞NirA的调控具有延迟性，诱导24h后调控作用才显著；缺氮培养导致胞内NirA含量显著下降，亚硝酸盐和铵盐对NirA表达有不同程度的抑制，硝酸盐对NirA表达有正调控作用；在缺氮的BG—11培养基中添加四种浓度的2—OG(0、0.5、1、10mM)诱导处理该藻，发现2—OG对NirA的表达有正调控作用，但幅度较硝酸盐小，并且正调控作用具有浓度依赖性，当浓度大于10mM后正调控幅度变小。提出了2—OG调控铜绿微囊藻氮源吸收的模型，探讨了2—OG用于水华控制的可行性。 最后，我们提取了经不同氮源及不同浓度2—OG诱导的铜绿微囊藻全蛋白进行差异蛋白组分析。氮源是藻细胞生长代谢所必需的营养，双向电泳结果显示有28个差异蛋白与不同氮源诱导相关。2-OG是藻细胞内C/N平衡的信号分子，其浓度变化对细胞代谢有着重要的影响。在双向电泳图谱中，我们找到了14个与2-OG诱导相关的差异蛋白。对这些差异蛋白点进行质谱鉴定后，把数据库搜索得到的差异蛋白的核酸序列与铜绿微囊藻的基因组序列比对，进一步分析结果的可靠性。之后我们对其中可靠性较高的10个蛋白与NirA表达调控及氮代谢调控的关系进行初步探讨：谷氨酰胺合成酶、天冬氨酸氨基转移酶和氨基转移酶主要与氨基转运和利用相关；2个ABE型转运系统蛋白参与多种化合物的膜间转运；PtsN(IIA Ntr与σ54依赖的氮代谢调节基因的转录相关；LysR家族的转录调节因子与氨基酸代谢调节相关；组氨酸蛋白激酶感受外界环境信号，使反应调节蛋白发生自身磷酸化，有多种重要的调控功能；翻译延伸因子负责翻译过程的肽链延伸，可能有伴侣蛋白的功能；过氧化氢酶可能参与细胞的增生与分化、凋亡、信号传导。