核酸的电、磁纯化新方法及其在微流控芯片中的应用研究

摘要

微全分析系统(μ-TAS)具备在芯片实验室上实现分析过程集成化、自动化和缩微化的特点，能够极大地减少试剂的消耗量、缩短分析时间、提高分析检测效率。因此，在疾病诊断、生化分析、临床检测等领域获得了普遍关注。通过不同功能芯片的使用，达到分析全过程多种功能的集成，是实现微全分析系统集成化的有效途径之一。针对复杂生化样品体系，样品预处理是实现整个μ-TAS分析的前提，而目前样品预处理技术正成为μ-TAS向集成化、高效率、连续化发展必须突破的瓶颈之一。 在基因分析和疾病检测中，常常需要进行DNA提取、DNA扩增和DNA分离检测等步骤，其中DNA的提取是决定基因分析成败与质量的关键步骤。传统的核酸提取方法具有操作繁琐，难以自动化等缺点。固液双相分离富集是一种既可实现待测物的浓缩富集又能够去除杂质组分干扰的样品预处理技术，而且它比较容易与微流控芯片系统结合实现在线预处理。 本论文发展了两种可用于捕获浓缩生物样品中DNA的固液双相分离富集方法--电渗析分离富集与磁珠法固相萃取，并把两种方法集成至微流控芯片中，实现生物样品的在线预处理，芯片易与其他芯片联用。论文共分为四章。 第一章为绪论，首先总结了DNA提取的一般过程与几种传统的DNA提取方法；然后介绍了膜分离技术尤其是电渗析技术及其在生物分离领域的应用；接着概述了磁性复合纳米颗粒的制备方法及其在DNA萃取中的应用；最后，论述膜分离技术与固相萃取技术在样品预处理微流控芯片中的集成和应用。 第二章构建一个可用于浓缩生物大分子(DNA)的电渗析装置。基于电渗析技术，利用阳离子交换膜在电场中对负电性物质的截留特性，在流路死体积中捕获并浓缩负电性物质。以阴性染料达旦黄作为探讨富集机理的模型化合物，研究了负电性物质在装置中的运动特点，并初步优化实验条件。生物大分子样品的实验结果表明：本装置在低电压条件下成功地实现无损伤捕获浓缩DNA分子，单体系的λ--DNA实验回收率约47％，浓缩液可直接用于PCR实验；装置具备较好的分离效能：从DNA-血红蛋白的混合体系中选择性地捕获浓缩DNA，去除绝大部分的蛋白质，浓缩液可直接用于PCR实验；从全血破碎液中成功地萃取出基因组DNA，二次浓缩液可用于PCR实验。本电渗析装置适用于分离具备不同电性的生物大分子，如等电点不同的蛋白质或核酸，实验操作自动简便，使用简单的有机试剂；也可用于一般的无机离子和生物小分子的纯化与预富集以降低对仪器的检测限要求；微型化可与微流控芯片联用或集成于芯片上，在生物样品的捕获、脱盐和分离等预处理过程中有很大的应用空间。 第三章发展了可控表面电性的超顺磁氨基化SiO2@Fe3O4复合纳米颗粒(Amino-Si-MNPs)用于核酸的分离纯化。采用水热法制备超顺磁的Fe3O4纳米粒子，通过SEM、TEM、XRD和MPMS超导量子干涉磁强计对其进行表征；运用Stober法对Fe3O4纳米粒子进行包覆得到粒径约300nm，具有核壳结构的SiO2@Fe3O4复合纳米颗粒；基于硅烷试剂的水解，利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)对SiO2@Fe3O4复合纳米颗粒进行氨基化表面改性，得到Amino-Si-MNPs。借助ZETA电位研究磁珠的表面电性，发现氨基化磁珠的表面电性对溶液的pH敏感，通过研究磁珠在萃取DNA体系中的电性，提出磁珠与DNA分子结合的机理。利用该磁珠成功地从全血中萃取得到基因组DNA，实验仅使用简单的、不对PCR产生干扰和抑制的试剂，萃取效率约70％，洗提液可直接用于PCR试验。本磁珠除了具有超顺磁性、分散性好等优点之外，其表面电性可通过调节溶液的pH得到控制、磁珠与DNA分子作用时，吸附和脱附速率快。这些优势使其成为一种良好的固定相，在DNA萃取等生物分离过程、在样品预处理芯片中具有广阔的应用前景。 第四章制作了两个基于固液双相分离富集技术的样品预处理芯片。其一把第二章基于电渗析技术的装置微型化并集成至微流控芯片中。以PMMA为材料，用激光刻蚀沟道，制作一个“三明治”式的分离浓缩芯片，阳离子膜依靠机械力固定于两层芯片间。在线观测达旦黄在芯片上的富集特性；以花菁类染料(Gene-finder)为荧光指示剂，在线监测DNA在该芯片中的富集特性。利用单体系DNA与DNA-血红蛋白混合体系研究芯片的浓缩和分离效能，结果表明：该芯片能够无损伤地捕获浓缩单体系与混合物体系中的DNA，浓缩液可直接供给PCR试验；在全血中基因组的提取实验中，该芯片能够捕获浓缩裂解液中的基因组DNA，但是纯度较低。芯片自动化程度高，试剂用量少等特点使具有与其他芯片联用的潜力，如与PCR芯片联用，用于分离PCR产物中的蛋白质；或与其他萃取芯片联用用于提取液的脱盐，浓缩等处理。 另一芯片基于第三章表面电性可控的氨基化磁珠技术，磁珠作为固定相填充于DNA萃取芯片中，借助外磁场固定于微通道中。芯片成功地从全血裂解液中萃取得到基因组DNA，洗提液可直接用于PCR实验。与传统的固相萃取芯片相比，磁珠芯片制作工艺要求低，磁珠填充与去除方便，试剂用量少、洗提液可直接用于进一步的生物分析等优势使该芯片具有与细胞破碎芯片、PCR芯片等联用的发展前景。 本论文发展的两种固液双相分离富集方法；把电渗析技术用于生物大分子的分离浓缩，并集成至微流控芯片，有效地实现在线富集与分离；制备表面电性可控的MNPs作为固定相用于核酸萃取，在芯片上实现DNA在线纯化与浓缩。在样品的预处理领域具有较大的应用空间。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1脱氧核糖核酸的提取过程

1.1.1 DNA提取前的预处理

1.1.2核酸与杂质分离的传统方法

1.2膜分离与电渗析技术及其在生物分离中的应用

1.2.1膜分离技术及其应用

1.2.2电渗析技术及其应用

1.3核酸固相萃取与纳米材料的应用

1.3.1核酸的固相萃取

1.3.2纳米材料简介

1.3.3二氧化硅纳米颗粒及其制备

1.3.4磁性纳米颗粒及其制备

1.3.5复合磁性纳米颗粒

1.3.6 SiO2复合磁性纳米颗粒及其表面改性

1.3.7高分子磁性纳米颗粒

1.4样品预处理微流控芯片与DNA萃取

1.4.1基于膜分离技术的在线富集芯片

1.4.2基于固相萃取的纯化浓缩芯片

1.5论文的研究目的与主要设想

参考文献

第二章 电渗析技术在核酸捕获浓缩中的应用

2.1引言

2.2实验部分

2.1.1试剂和仪器

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1达旦黄的富集特性

2.3.2 DNA捕获浓缩与无损伤检测

2.3.3 DNA与血红蛋白混合体系的实验结果

2.3.4全血中基因组DNA的试验结果

2.4本章小结

参考文献

第三章 可控表面电性的氨基化SiO2@Fe3O4复合纳米颗粒的制备、表征及其在DNA萃取中的应用

3.1引言

3.2实验部分

3.2.1试剂和仪器

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1水热法制备超顺磁Fe3O4纳米粒子的表征

3.3.2.St(o)ber法制备SiO2@Fe3O4复合纳米颗粒的表征

3.3.3氨基化SiO2@Fe3O4复合纳米颗粒的表征

3.3.4 Amino-Si-MNPs的表面电性研究与DNA萃取机理

3.3.5 Amino-Si-MNPs在基因组DNA萃取中的应用

3.6本章小结

参考文献

第四章 电渗析与磁珠技术在预处理芯片中的应用

4.1引言

4.2实验部分

4.2.1试剂与仪器

4.2.2基于电渗析技术的分离浓缩芯片

4.2.3基于磁珠技术的纯化浓缩芯片

4.3结果与讨论

4.3.1电渗析技术芯片实验结果

4.3.2磁珠技术芯片的实验结果

4.4本章小结

参考文献

结 论

研究结论

创新点

后续工作与展望

在学期间发表的与待发表论文

致谢