XBFD诱导H22荷瘤小鼠颗粒酶/穿孔素凋亡途径的分子机制研究

摘要

目的:研究小半夏加茯苓汤(Xiao Ban Xia Plus Fuling Decoction，XBFD)对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用，并通过血清学和肿瘤细胞凋亡相关分子表达水平的检测，探讨XBFD抗肿瘤的分子机制及其诱导细胞凋亡的途径，为XBFD在临床抗肿瘤应用提供理论和实验依据。
　　方法:建立体内H22荷瘤小鼠模型，随机分为荷瘤模型组，XBFD高剂量组，XBFD中剂量组，XBFD低剂量组，顺铂组，每组30只。接种次日开始给药，荷瘤模型组给予生理盐水10 g·kg-1，日一次;XBFD高、中、低剂量组，分别给予XBFD4g、2g、1g生药·mL-1水煎剂40、20、10 g·kg-1，日一次;顺铂组5 mg·kg-1腹腔注射0.9％氯化钠溶液稀释顺铂，分别于第1、4、7、10日各给药1次，观察小鼠生存状态及死亡情况等，实验第11日称重眼球取血后处死小鼠，取瘤体。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、苏木精-伊红(HE)染色、原位末端凋亡法(TUNEL)和免疫组化(IHC)检测肿瘤组织。
　　结果:(1)XBFD各剂量组给药后体重均增高，瘤重随剂量增大而降低，提示XBFD有明显的抑瘤效果。
　　(2) ELISA结果显示:与荷瘤模型组比较，XBFD中剂量组、顺铂组血清中的TNF-α的含量有明显的增加，XBFD高剂量组血清中的IL-2的含量有明显的增加。
　　(3) RT-PCR结果表明:与荷瘤模型组比较，XBFD各剂量组颗粒酶A表达升高，但无显著性差异;XBFD高、中剂量组颗粒酶B表达升高(p＜0.05); XBFD高、中剂量组穿孔素表达升高，促进颗粒酶/穿孔素途径非自愿性细胞凋亡。
　　(4) HE染色结果显示:建立的模型是成功的。
　　(5) TUNEL结果表明:XBFD能够增加H22细胞凋亡数量，且随药物剂量的增大凋亡率升高。
　　(6) IHC结果表明:XBFD各剂量药组颗粒酶A、颗粒酶B与穿孔素表达均较荷瘤模型组显著升高(p＜001），而且Bcl-2蛋白表达量随药物剂量增大呈下降趋势，Bax蛋白表达量随药物剂量增大呈上升趋势，调整Bcl-2/Bax比值。
　　结论:XBFD具有增强机体免疫功能，改善生存质量，抑制H22肝癌细胞增殖的作用，其诱导凋亡途径与颗粒酶/穿孔素参与的“非自愿细胞凋亡”及其增强Bax蛋白表达水平，降低Bcl-2蛋白表达水平有关，并且反映出XBFD对H22荷瘤小鼠的抑制作用有一定的量效关系。
　　抑瘤作用可能与以下机制有关:
　　1.提高TNF-α，IL-2的表达，从而激活T细胞活性和B细胞增殖，介导CTL发挥细胞毒作用。
　　2.提高穿孔素，颗粒酶的表达，从而促进穿孔素在细胞膜上形成孔道，颗粒酶大量进入细胞核激活自溶性核酸内切酶系统，使靶细胞DNA断裂，产生肿瘤细胞溶解和凋亡，诱导“非自愿细胞凋亡”。
　　3.通过增强Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达，调整Bax/Bcl-2比值，促进H22细胞的调亡。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 文献研究

1．XBFD的基本状况

1．1 XBFD的渊源

1．2 XBFD中单味药抗肿瘤的现代研究

1．3 XBFD对化疗呕吐临床观察与前期抗肿瘤研究

2．肿瘤的中医药研究进展

2．1 中医学阐述恶性肿瘤的历史沿革

2．2 痰饮与肿瘤关系的研究进展

2．3 XBFD抗肿瘤的中医理论研究

3．本课题研究设计思路

3．1 肿瘤免疫与凋亡关系

3．2 技术路线图

第二部分 实验研究

1．实验材料

1．1 肿瘤细胞

1．2 实验动物

1．3 实验药物

1．4 主要仪器设备

1．5 主要试剂

2．实验方法

2．1 H22荷瘤小鼠模型的建立

2．2 实验动物分组及给药

2．3 状态观察

2．4 ELISA

2．5 RT-PCR

2．6 HE染色

2．7 TUNEL染色

2．8 IHC

3．图像分析与数据统计

4．实验结果

4．1 XBFD对H22荷瘤小鼠一般状况的观察

4．2 XBFD对血清中TNF-α，IL-2含量的影响

4．3 XBFD对移植瘤中颗粒酶，穿孔素基因表达的影响

4．4 XBFD对病理形态学观察的影响

4．5 XBFD对移植瘤细胞凋亡影响

4．6 XBFD对移植瘤中颗粒酶，穿孔素蛋白表达的影响

4．7 XBFD对移植瘤中Bax，BCL-2蛋白表达的影响

第三部分 分析讨论

1．本实验细胞凋亡相关因子探讨

2．本实验相关材料探讨

3．实验方法和结果的分析

3．1 荷瘤小鼠生长情况的观察

3．2 ELISA检测H22荷瘤小鼠TNF-α，IL-2含量

3．3 RT-PCR检测移植瘤颗粒酶，穿孔素基因表达

3．4 HE和TUNEL染色检测病理组织

3．5 IHC方法检测瘤体中颗粒酶，穿孔素和BAX，BCL-2蛋白表达

4．本课题创新点

第四部分 总结与展望

参考文献

附录一 缩略词表

附录二 综述 小半夏加茯苓汤抗肿瘤的研究进展

附录三 图片

致谢

附录五 个人简历