海洋甲藻细胞周期调控的定量蛋白质组学研究:以东海原甲藻为例

摘要

东海原甲藻是引起我国近岸大范围、高频率有害藻华的主要甲藻，不仅对海洋生态系统造成了严重破坏，对海洋生物资源、水产养殖和公众健康也造成了严重威胁。尽管对东海原甲藻藻华形成的海洋学和生态学机制有了大量研究，但目前对东海原甲藻生长和增殖的调控机制了解较少。
　　 本论文建立了东海原甲藻细胞同步化培养方法，运用定量蛋白质组学技术，荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)技术和同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术对不同细胞周期时相的蛋白表达谱进行了研究，发现、鉴定了参与细胞周期调控蛋白及细胞周期调节蛋白;研究了东海原甲藻对氮饥饿和补充的生理和蛋白质组响应，探讨了东海原甲藻对环境中氮营养变动的适应和响应机制。主要研究结果如下:
　　 1.建立了东海原甲藻细胞同步化培养方法—周期垂直移动同步化方法。根据甲藻的垂直移动特性，通过收集相同垂直高度的藻细胞，使细胞同步化。该方法操作简便，同步化效率较高，为大批量甲藻同步化细胞的获取和细胞周期实验的开展提供了一种高效、快捷的途径。
　　 2.运用基于凝胶的定量蛋白质组学(2-D DIGE)技术结合MALDI-TOF-TOF生物质谱分析，比较研究了东海原甲藻不同细胞周期时相的蛋白表达谱，发现、确认了53个差异表达蛋白，成功鉴定到41个蛋白，这些蛋白参与了不同的生物学过程。在细胞的G1期，细胞内发生的主要生物学过程包括细胞结构和形态形成、蛋白质合成、光合作用和氧化还原反应，在S和G2/M期，细胞内主要进行DNA合成、蛋白质折叠、糖酵解和膜融合等过程。正是这些蛋白的时序性表达，共同调节着细胞周期的每一个环节，保证细胞顺利完成分裂和增殖。
　　 3.运用基于非凝胶的定量蛋白质组学（iTRAQ）技术结合LC-MS-MS质谱分析，比较研究了东海原甲藻不同细胞周期时相的蛋白质表达谱，成功鉴定到628个非冗余蛋白，其中200个为匹配到2个以上肽段的蛋白，包括细胞周期蛋白、核小体相关蛋白、DNA合成蛋白、转录相关蛋白、RNA代谢相关蛋白、分子伴侣、氨基酸合成蛋白、蛋白质合成、修饰和水解蛋白、ATP合成、水解和质子传递蛋白、光合作用蛋白、糖类和能量代谢蛋白、细胞结构和运动蛋白、金属离子结合蛋白、转运蛋白、氮代谢蛋白和核糖体蛋白。其中首次在东海原甲藻中发现了细胞周期蛋白、组蛋白和蛋白质水解相关蛋白。
　　 4.研究了氮饥饿和补充条件下东海原甲藻的细胞增殖，细胞周期和叶绿素含量变化。氮饥饿1天后，东海原甲藻细胞利用自身储存的氮进行细胞分裂和生长，叶绿素a含量变化不大，但从第2天开始，细胞生长和增殖缓慢，细胞密度变化不大，多数细胞不能进行分裂，滞留在G1期，细胞内叶绿素a含量不断下降。补充氮1天后，细胞的生长和增殖便恢复到正常水平，叶绿素a含量也迅速恢复，表明东海原甲藻对环境中氮的补充响应迅速。
　　 5.运用定量蛋白质组学技术(2-D DIGE)结合MALDI-TOF-TOF生物质谱分析，比较研究了东海原甲藻对氮饥饿和补充的的蛋白质组响应。发现、确认了56个差异表达蛋白，成功鉴定到37个蛋白，这些蛋白在细胞氮胁迫适应和氮补充响应方面起着重要作用。在氮饥饿的条件下，碳固定、光合作用和蛋白合成明显下降，而蛋白质降解和氮的重新利用明显增加。补充氮后，光合作用逐渐恢复，蛋白质降解和氮的重新利用降低。当东海原甲藻受到氮胁迫时，细胞内一些合成代谢结构被降解，以利于细胞对氮的重新分配和利用。谷氨酰氨合成酶(glutaminesynthetase，GS)在细胞内氮的重新利用方面起着重要作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 甲藻研究概况

1．1．1 甲藻的基本特性

1．1．2 甲藻和有害藻华

1．2 甲藻细胞周期研究进展

1．2．1 细胞周期同步化方法

1．2．2 细胞周期研究概况

1．2．3 甲藻细胞周期研究进展

1．2．4 氮胁迫对甲藻生长和生理的影响

1．3 甲藻蛋白质组学研究进展

1．3．1 蛋白质组学研究方法和发展趋势

1．3．2 甲藻蛋白质组学研究进展

1．4 本文研究的目的和内容

第二章 基于2-D DIGE方法的东海原甲藻细胞周期定量蛋白质组学研究

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 藻种及其培养条件

2．2．2 细胞同步化方法

2．2．3 东海原甲藻大规模同步化培养

2．2．4 流式细胞分析

2．2．5 细胞计数

2．2．6 蛋白提取

2．2．7 蛋白定量

2．2．8 2-D DIGE分析

2．2．9 凝胶的硝酸银染色

2．2．10 蛋白质酶解

2．2．11 蛋白质质谱分析

2．2．12 数据库搜索

2．2．13 增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白免疫印迹验证

2．3 结果

2．3．1 不同同步化方法下细胞周期各时相变化

2．3．2 大规模培养下东海原甲藻的细胞密度变化

2．3．3 东海原甲藻细胞周期时相

2．3．4 东海原甲藻细胞周期蛋白表达谱

2．3．5 差异表达蛋白鉴定和功能分类

2．3．6 PCNA免疫印迹验证

2．4 讨论

2．4．1 不同同步化方法的细胞同步化效率

2．4．2 细胞周期和细胞分裂蛋白

2．4．3 RNA代谢

2．4．4 蛋白质代谢

2．4．5 氧化还原过程

2．4．6 细胞结构蛋白

2．4．7 能量代谢和碳代谢

2．4．8 ABC转运蛋白

2．4．9 其他功能蛋白

2．5 本章小结

第三章 基于稳定同位素标记技术的东海原甲藻细胞周期蛋白质组学研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 藻种及培养条件

3．2．2 细胞周期同步化

3．2．3 流式细胞分析

3．2．4 细胞计数

3．2．5 蛋白提取

3．2．6 蛋白定量

3．2．7 酶解和肽段定量

3．2．8 肽段标记

3．2．9 肽段的强阳离子交换柱(SCX)分级

3．2．10 质谱分析

3．2．11 数据分析

3．3 结果

3．3．1 东海原甲藻的生长动态

3．3．2 东海原甲藻细胞周期时相

3．3．3 肽段SCX分离

3．3．4 蛋白质鉴定结果

3．3．5 差异表达蛋白

3．4 讨论

3．4．1 iTRAQ与2-D DIGE结果比较

3．4．2 细胞周期和细胞分裂相关蛋白

3．4．3 组蛋白

3．4．4 转录相关蛋白

3．4．5 DEAD box家族

3．4．6 蛋白质合成

3．4．7 蛋白质降解

3．5 本章小结

第四章 东海原甲藻对氮饥饿和补充的蛋白质组响应

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．2．1 藻种及培养条件

4．2．2 东海原甲藻氮饥饿和氮补充培养

4．2．3 细胞计数

4．2．4 细胞叶绿素a含量测定

4．2．5 细胞内颗粒有机碳(POC)和颗粒有机氮(PON)的测定

4．2．6 蛋白质提取

4．2．7 蛋白质的定量

4．2．8 双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)分析

4．2．9 凝胶的硝酸银染色

4．2．10 蛋白质酶解

4．2．11 蛋白质质谱分析

4．2．12 数据库搜索

4．2．13 RuBisCo Ⅱ蛋白免疫印迹验证

4．3 结果

4．3．1 氮饥饿对东海原甲藻细胞生长的短期影响

4．3．2 氮补充对东海原甲藻短期生长的影响

4．3．3 东海原甲藻细胞生长的动态变化

4．3．4 叶绿素a含量的变化

4．3．5 细胞内颗粒有机碳(POC)和颗粒有机氮(PON)含量变化

4．3．6 不同氰营养条件下东海原甲藻蛋白质组差异表达

4．3．7 差异表达蛋白鉴定和功能分类

4．3．8 RuBisCO Ⅱ的免疫印迹l验证

4．4 讨论

4．4．1 氮饥饿对细胞生长的影响

4．4．2 氮补充对细胞生长的影响

4．4．3 氮饥饿对碳代谢过程的抑制

4．4．4 氮饥饿对蛋白质代谢的影响

4．4．5 氮饥饿诱导GroEL-GS复合体表达上调

4．4．6 含氮化合物降解产物的再利用

4．4．7 其他差异表达蛋白的生物学功能

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 本论文的特色和创新点

5．3 不足及展望

参考文献

附录

附录Ⅰ 2-D DIGE方法比较东海原甲藻细胞周期的差异蛋白点

附录Ⅱ iTRAO方法比较东海原甲藻细胞周期的蛋白点

附录Ⅲ 东海原甲藻在氮饥饿和氮补充时的差异蛋点

攻读博士学位期间发表论文及参加会议情况

致谢