NF-κB诱骗剂诱导大鼠特异性耐受型树突状细胞的构建及性能评价

摘要

目的:
　　运用NF-κB诱骗剂（NF-κB ODN Decoy）构建大鼠耐受性树突状细胞(dendritic cell，DC)，并将其负载牛Ⅱ型胶原(BⅡC)，对其形态学特征、共刺激分子表型以及体外刺激淋巴细胞的能力等性能进行评价，为最终将其应用于类风湿性关节炎大鼠模型提供理论依据。
　　方法:
　　取SD大鼠脾脏单核细胞，用GM-CSF和IL-4诱导其转化为DC，根据不同处理对培养细胞分成五组:(1)单纯培养DC组(Control-DC):加入细胞因子直接诱导培养;(2) LPS刺激DC组(LPS-DC):在用细胞因子直接培养第7天加入终浓度为10μg/ml的LPS继续培养;(3) Decoy诱导DC组(Decoy-DC):在培养开始加入细胞因子同时加入大鼠NF-κB ODN Decoy，使终浓度为5μ mol/L;(4) LPS刺激Decoy-DC组(LPS-Decoy-DC):还需在加入大鼠NF-κ B ODN Decoy培养后第7天加入终浓度10μg/ml的LPS继续培养;(5)负载BⅡC的Decoy-DC组(BⅡC-Decoy-DC):在加入大鼠NF-κ B ODN Decoy培养后第6天时加入BⅡC，使终浓度为50μ g/ml。
　　对上述培养DC进行性能评价:
　　①相差显微镜或Gimsa染色后观察细胞形态特征，台盼蓝染色法评价细胞活力，流式细胞术检测大鼠DC特异性标志0X-62评价培养DC纯度;
　　②流式细胞术检测培养细胞共刺激分子CD80、CD86表达情况，评价DC的成熟状态;
　　③同种异体淋巴细胞刺激试验评价Decoy诱导的耐受性DC刺激淋巴细胞增殖的能力，并检测上清液中IFN-γ和IL-10水平。
　　结果:
　　①各实验组DC活力均＞92％，大鼠特异性标志OX-62的表达率＞70％;大多数大鼠脾脏来源DC呈CD80+/CD86-的表型特征;
　　②与Control-DC和LPS-DC比较，Decoy-DC组中相对成熟的贴壁细胞和毛发样突起细胞均较少，细胞表面共刺激分子CD80和CD86阳性表达率和（或）表达强度均呈明显降低（P＜0.05）;与Control-DC经LPS刺激后共刺激分子表达明显上调相比，Decoy-DC经LPS刺激后CD80表达强度以及CD86阳性表达率和表达强度上调均不明显（P＞0.05）;
　　③BⅡC-Decoy-DC形态学与单纯Decoy-DC无明显差别，也同样呈CD80和CD86低表达;
　　④Decoy-DC刺激淋巴细胞增殖的能力明显低于Control-DC和LPS-DC(P＜0.05)，同时，其刺激淋巴细胞低分泌IFN-γ（与Control-DC和LPS-DC比较P＜0.05），高分泌IL-10（与LPS-DC比较P＜0.05）;与Decoy-DC相目比，LPS-Decoy-DC刺激淋巴细胞的能力未见明显提高;
　　⑤对BⅡC-Decoy-DC，在不同的抗原存在时，其刺激淋巴细胞反应的能力有着明显的不同:与BⅡC作为刺激抗原相比，健康人血清可刺激淋巴细胞明显增殖（P＜0.05），高分泌IFN-γ以及低分泌IL-10（P均＜0.05）。
　　结论:
　　①本实验改良了大鼠脾脏来源DC的培养方法，效果良好，获得了活性在92％以上，纯度在70％以上的DC;
　　②成功用NF-κ B ODN Decoy策略构建了形态及表型均稳定的耐受性DC。它不仅具有相对不成熟的免疫表型，同时刺激同种异体淋巴细胞反应的能力较低，且抑制淋巴细胞免疫反应向Th1方向偏移，对LPS的刺激表现了一定的稳定性。
　　③成功制备负载了特异性抗原BⅡC的耐受性DC，受之刺激的淋巴细胞表现出针对该抗原的特异性耐受，而对无关抗原的免疫应答没有明显影响。

目录

摘要

前言

1．材料

1．1 实验动物

1．2 主要试剂及配置方法

1．3 主要仪器

2．实验方法

2．1 DC细胞的培养

2．2 流式细胞术检测细胞表面标志

2．3 DC体外刺激同种异体淋巴细胞的反应

2．4 混合淋巴细胞反应培养上清液细胞因子检测

2．5 统计学处理

3．实验结果

3．1 体外诱导培养DC的形态特征

3．2 细胞表面OX62标志检测

3．3 细胞表面CD80和CD86分子的表达

3．4 DC对同种异体淋巴细胞的刺激反应

3．5 DC与同种异体淋巴细胞混合培养后上清液IFN-γ和IL-10检测结果

4．讨论

4．1 改良文献的DC培养方法，获得了纯度较高的DCs

4．2 利用NFκB ODN Decoy技术构建耐受性DC

4．3 NF-κB ODN Decoy技术构建耐受性DC的稳定性评价

4．4 负载BⅡC的耐受性DC的构建及评价

4．5 NF-κB ODN Decoy构建的抗原特异性耐受性DC对同种异型淋巴细胞的刺激能力

结论

参考文献

致谢

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