右旋糖酐定量检测试剂盒的研制及其初步应用

摘要

右旋糖酐(Dextran)，又名葡聚糖，由Leuconostoc mesenteroides等微生物产生的酶聚合葡萄糖而成或葡萄糖通过化学聚合而成。右旋糖酐广泛应用于医药、食品、化工等领域。在医学领域的应用主要包括:作为血浆体积扩张剂，作为抗凝剂，以及作为渗透压调节剂用于相关的疾病治疗。一般机体组织细胞并不能直接利用右旋糖酐，主要从尿液排出，右旋糖酐使用过量会引起急性肾衰竭、充血性心衰竭、肺水肿及血小板减少等毒副作用。因此，监测血液、尿液的右旋糖酐含量是指导右旋糖酐用量的重要指标，同时右旋糖酐也是诊断血液或尿道微生物感染的依据，另外右旋糖酐的定量监测也是食品工业质控的一个重要指标与技术。本论文研究利用抗右旋糖酐单克隆抗体建立简便、快速的右旋糖酐竞争ELISA定量检测试剂盒。
　　首先，利用右旋糖酐与BSA交联物作为免疫原，免疫4～6周龄雌性BALB/c小鼠，通过细胞融合技术筛选获得3株（命名为D9，D24，D27）稳定分泌抗右旋糖酐单克隆抗体杂交瘤细胞株。腹腔注射D24杂交瘤细胞制备腹水，经rProtein A亲和柱纯化得到了纯度较高的抗体（抗体纯度约为95％，浓度约为2 mg/mL）;间接ELISA结果表明抗体效价达到2.5×10-5，表明抗体具有较高的特异性和亲和力。
　　其次，利用抗右旋糖酐单克隆抗体建立右旋糖酐竞争ELISA定量检测方法，确定检测体系优化条件:(1)抗原包被浓度为1.25 tg/mL;(2)包被时间为4℃过夜;(3)封闭液为2％ BSA;(4)右旋糖酐单克隆抗体稀释度为1:8000;(5)竞争反应时间为37℃，1 h;(6)底物作用时间为10 min。该优化检测体系对dextran2000标准品在浓度19.53 ng/mL～1250 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数R2=0.9964;体系最低检测限为9.6 ng/mL;标准品回收率在90.7％～115.6％之间;批内、批间变异系数均小于15％，表明该检测方法具有良好的灵敏度和较高的准确性。
　　最后，利用建立的定量检测方法测定临床样品，结果表明，45份人血清和尿液样品中，29份未检出右旋糖酐(＜9.6 ng/mL);有16份可检出右旋糖酐（范围:10.0±1.2 ng/mL～22.2±2.8 ng/mL），其中有2份尿液样品出现较高浓度右旋糖酐，比一般尿液右旋糖酐检出均值(14.3 ng/mL)高5倍以上，提示这两份样品可能受到微生物的感染，与临床诊断尿路感染相符。竞争ELISA测定的结果与双抗体夹心ELISA法测定的结果相似，进一步证实竞争ELISA在临床上测定右旋糖酐含量的可行性。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 绪论

1．1 右旋糖酐的简介

1．1．1 右旋糖酐的结构

1．1．2 右旋糖酐的性质

1．1．3 右旋糖酐的分类

1．2 右旋糖酐的应用

1．2．1 右旋糖酐在医学上的应用

1．2．2 右旋糖酐在食品工业上的应用

1．2．3 右旋糖酐在化工上的应用

1．2．4 右旋糖酐在其他领域上的应用

1．3 右旋糖酐检测技术概述

1．3．1 医学上右旋糖酐测定技术

1．3．2 制糖行业右旋糖酐测定技术

1．4 右旋糖酐单克隆抗体及应用

1．5 研究目的和内容

第二章 右旋糖酐单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 细胞株和实验动物

2．1．2 主要试剂及耗材

2．2 主要仪器及设备

2．3 主要溶液的配制

2．4 实验方法

2．4．1 Dextran 40和BSA、OVA交联物的制备

2．4．2 杂交瘤细胞株的建立

2．4．3 抗体亚型的鉴定

2．4．4 抗体的生产

2．4．5 抗体的纯化、透析和冻干

2．4．6 抗体的效价测定

2．4．7 抗体的特异性鉴定

2．5 结果与分析

2．5．1 Dextran 40-BSA交联物的制备

2．5．2 小鼠血清效价测定

2．5．3 杂交瘤细胞株的建立

2．5．4 抗体纯度测定

2．5．5 抗体效价测定

2．5．6 特异性鉴定

2．6 本章小结

第三章 右旋糖酐竞争ELISA检测方法的建立

3．1 供试材料

3．2 方法

3．2．1 血清和尿液样品的收集

3．2．2 右旋糖酐标准品配制

3．2．3 抗原包被浓度和抗体工作浓度的确定

3．2．4 竞争ELISA方法

3．2．5 竞争ELISA体系的优化

3．2．6 竞争ELISA反应体系特性研究

3．2．7 竞争ELISA法的初步应用

3．3 结果与分析

3．3．1 抗原包被浓度和单抗工作浓度

3．3．2 竞争ELISA体系的优化

3．3．3 竞争ELISA反应体系特性研究

3．3．4 竞争ELISA法的初步应用

3．4 本章小结

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 本文存在的问题和今后开展的研究

参考文献

致谢