超临界流体技术制备磁性丝素蛋白纳米粒及联合磁导入用于经皮给药研究

摘要

经皮给药系统可避免胃肠及肝脏的首过效应，具有血药浓度稳定、给药方便等优点，在降低不良反应、提高治疗指数和用药顺应性方面具有明显的优势。然而皮肤的角质层作为生物屏障之一，限制了很多药物的经皮渗透。为了突破皮肤角质层的屏障作用，纳米药物载体成为促进药物经皮渗透的一种有效方式，同时，磁导入技术作为一种主动促渗方式能够有效促进药物经皮渗透。本文选用甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）为模型药物，以丝素蛋白（silkfibroin，SF）为药物载体，采用超临界流体强制分散悬浮液法（suspension-enhanced dispersion by supercritical CO2，SpEDS）制备载甲氨蝶呤-丝素蛋白纳米粒（MTX-SFNPs）和载甲氨蝶呤-磁性丝素蛋白纳米粒（MTX-Fe3O4-SF NPs），对其理化性能、载药性能进行考察；同时联合磁性丝素蛋白纳米粒及外加磁场用于经皮给药研究，并初步探讨其促渗机理；最后对两种载体的细胞毒性及皮肤刺激性进行考察。
　　（1）利用SpEDS法制备SF NPs及Fe3O4-SF NPs，并对纳米粒的形貌、粒径大小分布进行表征，结果表明：当SF/Fe3O4=20:3时，能制备出球形度好、粒径均一的Fe3O4-SF NPs；以 MTX为模型药物，制备 MTX-SF NPs和MTX-Fe3O4-SF NPs，研究结果表明：两种载药纳米粒的粒径较小（<100 nm）、粒径分布均一，FTIR显示MTX成功负载于SF；两种载药纳米粒具有较高的载药量，且随着载药量的升高，包封率有所下降，药物的体外释放与原料药相比具有一定的缓释效果。
　　（2）以MTX-SF NPs进行体外经皮渗透实验，实验结果表明，给药24 h后，MTX-SF NPs组中MTX单位面积累积经皮渗透量约达89.20±1.86μg/cm2，约是MTX组（26.76±2.92μg/cm2）的3.33倍，表明MTX-SF纳米粒能显著提高MTX的经皮渗透量；CLSM观察结果显示，纳米粒组在皮肤的真皮层能观察到荧光信号，而对照组仅在皮肤的表面观察到荧光信号。
　　（3）以MTX-Fe3O4-SF NPs进行体外经皮渗透实验，同时联合固定磁场及MTX-Fe3O4-SF NPs进行体外经皮渗透实验，实验结果表明，给药24 h后，在外加磁场的作用下，MTX-Fe3O4-SF NPs的单位面积累积经皮渗透量（91.35±2.01μg/cm2）高于无外加磁场组（67.87±3.08μg/cm2），表明磁导入联合磁性纳米粒对MTX的经皮渗透有明显的促进效果。皮肤预处理经皮给药实验及ATR-FTIR分析皮肤角质层特征吸收峰结果表明固定磁场不影响皮肤结构，固定磁场促进药物经皮渗透的主要机理为磁性作用力。
　　（4）以MTX-Fe3O4-SF NPs进行体外经皮渗透实验，同时联合交变磁场及固定/交变磁场进行经皮给药实验。实验结果表明，不同种类的外加磁场都能够有效地促进MTX的经皮渗透。对照组MTX-Fe3O4-SF NPs的MTX的单位面积累积经皮渗透量为11.37±0.55μg/cm2。纳米粒联合固定磁场组为13.83±0.85μg/cm2，而纳米粒联合交变磁场组为19.08±2.67μg/cm2，纳米粒联合固定/交变磁场组为27.39±1.70μg/cm2，这说明纳米粒联合交变磁场能够更有效地促进MTX的经皮渗透，磁场对磁性纳米粒子水平方向的作用力比垂直方向的作用力更能有效地促进MTX的经皮渗透。重要的是，联合两种磁场同时产生水平及垂直方向的作用力达到类似模拟物理按摩的效果，从而更能促进药物MTX的经皮渗透。
　　通过CLSM观察皮肤中的荧光分布及ATR-FTIR分析皮肤角质层的脂质构象初步探讨促渗机理。CLSM观察结果显示，相较于对照组，联合固定磁场组能观察到更强的荧光，而联合交变磁场及固定/交变磁场组能在皮肤的更深处观察到荧光，这是由于联合固定/交变磁场模拟物理按摩促进了毛囊渗透。ATR-FTIR分析结果得出交变磁场能够使皮肤的角质层构象由凝胶态变为液晶态，这增加了皮肤的流动性，从而促进药物的经皮渗透。
　　（5）采用细胞培养法表征SF NPs和Fe3O4-SF NPs的生物相容性，采用Alamar Blue法检测两种纳米粒与HES细胞进行共培养时的细胞毒性，形态观察结果显示两种纳米粒对HES细胞的细胞毒性反应为1级；皮肤刺激性实验结果表明，这两种纳米粒对皮肤具有极轻微的刺激性，因而这两种纳米粒适合用于作为经皮给药的药物载体。

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第1章 引言

1.1 前言

1.2 人体皮肤的结构

1.3 药物经皮渗透途径及促渗方法

1.4 聚合物纳米粒促进药物经皮渗透

1.5 聚合物纳米粒联合主动渗透方式促进药物经皮渗透

1.6 丝素蛋白

1.7 超临界流体技术制备丝素蛋白纳米粒

1.8 本论文拟开展的工作

第2章 （磁性）丝素蛋白纳米颗粒的制备

2.1 引言

2.2 材料和仪器

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章讨论与小结

第3章 甲氨蝶呤-丝素蛋白纳米粒体外经皮给药研究

3.1 引言

3.2 材料和仪器

3.3 实验方法

3.5 实验结果与讨论

3.6 本章讨论与小结

第4章 固定磁场联合磁性丝素蛋白纳米粒经皮给药研究

4.1 引言

4.2 材料和仪器

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 本章讨论与小结

第5章 交变磁场联合磁性丝素蛋白纳米粒经皮给药研究

5.1 引言

5.2 材料和仪器

5.3 实验方法

5.4 实验结果与讨论

5.5 本章讨论与小结

第6章 纳米粒生物相容性研究

6.1 引言

6.2 材料和仪器

6.3 实验方法

6.4 实验结果

6.5 本章讨论与小结

第7章 总结与展望

7.1 结论

7.2 后续工作建议

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果