三叶因子1与醛酮还原酶A1C1相互作用的验证

摘要

目的：应用免疫共沉淀方法证TFF1与候选结合蛋白ARK1C1的相互作用关系，并通过荧光共聚焦显微镜对TFF1及AKR1C1进行细胞内共定位，从而确定TFF1及结合蛋白的相互作用，为进一步明确其结构和功能，为探讨TFF1在胃肠道肿瘤中发生、转移的内在机制和作用及信号通路提供实验基础。 方法：应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增TFF1序列，定向克隆到pCMV-NF-kB构建表达TFF1的融合质粒，命名为pCMV-NF-kB-TFF1，westernblot法验证pCMV-NF-kB-TFF1的表达。根据前期实验室内正向酵母双杂交筛选TFF1候选结合蛋白的结果，PCR法扩增AKR1C1基因构建成表达AKR1C1的融合质粒，命名为pCMV-GAL4-AKR1C1，Western blot法验证AKR1C1基因在人胚肾细胞293-FT中的表达。pCMV-NF-kB-TFF1与pCMV-GAL4-AKR1C1共转染人胚肾293FT细胞，利用相应抗体做二者的免疫共沉淀，以验证蛋白TFF1和AKR1C1之间的相互作用。其次pCMV-NF-kB-TFF1与pCMV-GAL4-AKR1C1共转染HEK293FT，利用荧光共聚焦显微镜观察二者在细胞内的定位。 结果：成功构建了NF-kB-TFF1融合质粒、GAL4-AKR1C1融合质粒；Westernblot法证实转染的293-FT细胞能正确表达NF-kB-TFF1融合蛋白、GAL4-AKR1C1融合蛋白。免疫共沉淀结果显示，TFF1蛋白可以在GAL-4抗体的免疫沉淀物中检测出来，同样在抗NF-kB抗体的免疫沉淀物中也能检测到蛋白AKR1C1。免疫共聚焦的结果显示二者荧光在细胞内存在部分共定位，二者的荧光有部分融合。 结论：TFF1与AKR1C1在哺乳细胞内存在某种本互作用，为进一步研究TFF1的功能及相关机制提供了线索。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

主要材料、仪器、配方及操作方法

第一部分重组质粒的构建及鉴定

第二部分免疫共沉淀验证TFF1与AKR1C1的关系

第三部分TFF1与AKR1C1的细胞内共定位分析

结 论

参考文献

致 谢

综述:三叶因子1的研究与进展

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