脆性X综合征分子诊断方法体系的建立及其疾病基因新型可变剪接转录产物的鉴定

摘要

脆性X综合征(fragile X syndrome，FXS)是一种常见的遗传性智力障碍疾病。1991年在Xq27.3处克隆了该病的疾病基因——脆性X智力障碍1基因(fragile X mental retardation1 gene，FMR1)。FMR1基因跨越38Kb，由17个外显子和16个内含子组成，编码一功能未明的RNA结合蛋白。已证实FMR1基因存在多种可变剪接方式，主要涉及四个外显子，并且在不同组织中其剪接形式并非一致，但其具体的功能仍未明确。同时，FXS发病率高、临床表现复杂多样、并存在传递扩展的遗传特性，因此，建立完善的实验室诊断方法尤为重要。 本研究依据FMR1基因突变的特点，分别从基因组DNA和mRNA两条途径建立FXS分子诊断方法。采用甲基化特异性PCR，从基因组DNA途径检测FMR1基因5’端非翻译区CGG重复情况和CpG岛甲基化状态；采用长链RT-PCR技术，以cDNA为模板，扩增FMR1基因编码区全长序列，再分4个片段进行二次PCR，并对PCR产物直接测序。利用上述方法对一疑似FXS患者及其家系成员进行了检测。 同时，本研究利用克隆-测序技术，从RNA水平对该患者外周血FMR1基因的可变剪接产物进行分析。利用长链RT-PCR扩增FMR1基因编码序列，并将其插入T克隆载体进行序列测定，进一步分析剪接异构体表达情况。结果显示：在所检测的19个克隆中存在11种剪接转录产物，其中发现6个涉及FMR1基因内含子9部分片段的插入的剪接转录产物(6/19)。针对新发现的FMR1基因内含子9部分片段的插入的剪接方式，本研究利用生物信息学技术对FMR1基因内含子9序列进行剪接信号相关分析，证明该内含子插入片段可能为一个隐秘外显子(cryptic exon)。同时，分析结果显示，该隐秘外显子的出现，提前引入终止密码子，可能通过NMD途径导致转录产物降解，使功能性FMRP减少。 本研究还利用克隆-测序技术，以四个正常人外周血样本和一份脑组织cDNA文库为模板，进一步分析了FMR1基因剪接转录产物表达情况。结果显示：在所检测的四个正常人外周血中共检测到16种剪接产物，不同个体存在不同程度的FMR1基因剪接表达，并在一个正常人中发现两个未曾报道过的剪接产物；而在脑组织中共检测到9种剪接产物，并从中发现一个涉及外显子15一个新的剪接受点的剪接产物。 本研究建立的一套FXS分子诊断方法体系，将为FXS的临床诊断、产前诊断和遗传咨询提供可靠的科学依据。发现的新型可变剪接转录产物，将为研究FMRP功能、FXS发病机制奠定基础。

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英文文摘

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引言

第一部分脆性X综合征分子诊断方法体系的建立

材料和方法

1实验材料

2实验方法

结果

讨论

第二部分FMR1基因新型可变剪接转录产物的鉴定

材料和方法

1研究对象和样本

2实验材料

3实验方法

结果

讨论

小 结

参考文献

致 谢

综述(一)脆性X综合征实验室诊断研究进展

综 述(二)剪接变异体及其意义

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