辣椒内生枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）防病促生作用的研究

摘要

该研究对辣椒内生细菌及其拮抗菌进行了分离筛选,着重对其中2株分别来自辣椒叶片和茎杆的BS-2和BS-1菌株的鉴定、内生定殖、防病促生作用及其机制,B-2菌株的抗菌物质和发酵条件等进行了研究.辣椒内生细菌分离结果表明,在所选用的分离条件下,辣椒组织体内含有2.83×10<'3>~1.35×10<'4>cfu/g(fw)的细菌;不同品种或同一品种不同组织器官内,体内细菌的数量有所不同,叶片内细菌的含量最高,果中最少,叶、根、茎和果中细菌含量分别为3.4×10<'3>~4.5×10<'4> cfu/g(fw)、0.75×10<'3>~1.3×10<'3> cfu/g(fw)、0.1×10<'3>~3.25×10<'3> cfu/g(fw)和0.3×10<'3>~1.8×10<'3> cfu/g(fw).室内拮抗作用测定表明,所获得的108株细菌中,有31株(占28.7﹪)对香蕉、黄瓜枯萎病等10多种植物病原真菌具有拮抗作用,其中以分别来自辣椒叶片和茎杆中的BS-2和BS-1菌株的拮抗作用最强、最稳定.经形态和生化特征等测定,上述具有拮抗作用的31株细菌均为芽孢杆菌(Bacillus spp.);其中BS-2和BS-1菌株经Biolog鉴定为枯草芽孢杆菌(B. subtilis),再经16S rRNA序列分析比较,2菌株进一步鉴定为枯草芽孢杆菌内生亚种(B.subtilis subsp. endophyticus).以抗利福平(300μg/ml)和拮抗病原真菌双抗性为标记,测定BS-2和BS-1菌株的内生定殖寄主范围及其在辣椒和白菜体内的定殖动态表明,浸种、灌根和涂抹叶片等方法接种,两菌株均可以进入辣椒、茄子、白菜、甜瓜、西瓜、丝瓜等植物体内定殖,除此之外,BS-2菌株还可以在蕃茄、黄瓜、豇豆、水稻和小麦等植物体内定殖;BS-2菌株的内生寄主范围比BS-1菌株广、内生定殖作用强.室内测定2菌株在辣椒体内和室外田间测定BS-2在白菜体内定殖动态表明,浸种、灌根及涂抹叶片等方法接种后,菌株均可主动进入辣椒和白菜体内定殖,并迅速向接种点上部、未接种的组织器官转移传导,并可在辣椒和白菜体内长期定值.

目录

引言

1植物内生细菌的研究背景

1.1概念

1.2研究历史

1.3生态学研究

1.3.1分离

1.3.2种类

1.3.3在植株体内的种群数量

1.3.4来源

1.3.5进入植物体内的途径

1.3.6在植物体内的定殖检测

1.3.7在植物体内的消长动态

1.4生物学作用及其机制

1.4.1植物保护作用

1.4.2防病机制

1.4.3在非豆科植物中的生物固氮作用

1.4.4对寄主植物的促生作用

1.4.5作为外源基因载体

1.4.6内生细菌的不利影响

1.5植物内生枯草芽孢杆菌研究现状及问题

2辣椒内生细菌的分离、拮抗菌的筛选与鉴定

2.1材料与方法

2.1.1供试辣椒品种

2.1.2供试病原菌及来源

2.1.3分离和培养用培养基

2.1.4内生细菌分离方法

2.1.5室内拮抗病原真菌测定

2.1.6细菌鉴定

2.2结果与分析

2.2.1不同品种和种植地辣椒内生细菌的数量

2.2.2拮抗植物病原真菌的辣椒内生细菌筛选

2.2.3拮抗内生细菌的常规和Biolog鉴定

2.2.4 WCAB-2和WCDE-1菌株的分子生物学鉴定

2.3小结与讨论

3 BS-2和BS-1菌株内生定殖研究

3.1材料与方法

3.1.1供试菌株

3.1.2供试植物及品种

3.1.3抗利福平(Rif)突变菌株的筛选

3.1.4 BS-2和BS-1菌株内生寄主范围测定接种方法

3.1.5 BS-2和BS-1在植物体内定殖测定

3.1.6定殖菌的回收及鉴定

3.2结果与分析

3.2.1不同方法接种抗Rif标记BS-2和BS-1菌株在辣椒体内的定殖分离结果

3.2.2抗Rif标记BS-2和BS-1菌株的培养性状及对病原菌拮抗作用测定

3.2.3 BS-2和BS-1菌株浸种处理在各植物体内的定殖结果

3.2.4 BS-2和BS-1菌株涂抹叶片和土壤浇灌接种在各植物体内的定殖结果

3.2.5不同浸种时间BS-2菌株在辣椒和白菜体内的定殖结果

3.2.6不同浓度BS-2菌株浸种在辣椒和白菜体内的定殖结果

3.2.7 BS-2和BS-1在辣椒体内定殖消长动态

3.2.8 BS-2菌株在白菜体内的定殖时间

3.3小结与讨论

4 BS-2和BS-1菌株对辣椒和白菜的促生作用

4.1材料与方法

4.1.1供试菌株及培养条件

4.1.2供试作物及品种

4.1.3 2菌株培养液浸种对辣椒、白菜苗生长的测定

4.1.4 BS-2菌株浸种处理后辣椒和白菜体内内源激素含量测定

4.2结果与分析

4.2.1 BS-2和BS-1菌株对辣椒苗促生室内盆栽和室外小区试验结果

4.2.2 BS-2和BS-1菌株对白菜苗生长的影响

4.2.3 BS-2菌株浸种处理后辣椒和白菜体内各内源激素含量变化

4.3小结与讨论

5 BS-2和BS-1菌株对植物炭疽病的防治作用

5.1材料与方法

5.1.1供试菌株

5.1.2培养基

5.1.3供试品种

5.1.4对辣椒炭疽病的防治

5.1.5防治白菜炭疽病盆栽试验

5.1.6对香蕉果炭疽病的防治试验

5.2结果与分析

5.2.1对甜椒苗炭疽病的防治效果

5.2.2对采后甜椒果炭疽病的防治效果

5.2.3菌株菌体及其胞外分泌物对甜椒果炭疽病的防病作用

5.2.4对采后皱皮辣椒炭疽病的防治效果

5.2.5对白菜炭疽病的防治效果

5.2.6对香蕉炭疽病的防治效果

5.3小结与讨论

6 BS-2和BS-1菌株防治炭疽病机制研究

6.1材料与方法

6.1.1对辣椒、白菜、香蕉炭疽病菌菌丝抑制作用测定

6.1.2对辣椒、白菜、香蕉炭疽病菌分生孢子形成抑制作用测定

6.1.3对辣椒、白菜、香蕉炭疽病菌分生孢子萌发抑制作用测定

6.1.4防治采后辣椒果炭疽病机制的研究方法

6.2结果与分析

6.2.1对辣椒、白菜、香蕉炭疽病菌菌丝生长的影响

6.2.2对辣椒、白菜、香蕉炭疽病菌分生孢子形成的影响

6.2.3对辣椒、白菜、香蕉炭疽病菌分生孢子萌发的影响

6.2.4菌株对采后辣椒果炭疽病防治机制研究结果

6.3小结与讨论

7 BS-2菌株的抗菌物质及其特性

7.1材料与方法

7.1.1供试菌株

7.1.2菌株培养

7.1.3抗菌蛋白的提取

7.1.4抗菌蛋白活性测定——打孔法

7.1.5抗菌蛋白热稳定性测定

7.1.6抗菌蛋白吸光值测定

7.1.7抗菌蛋白常规PAGE和SDS-PAGE检测

7.1.8抗菌蛋白MALDI-TOF质谱检测

7.1.9抗菌蛋白高效液相色谱(HPLC)检测

7.1.10抗菌蛋白抗紫外线活性测定

7.1.11抗菌蛋白pH稳定性测定

7.1.12抗菌蛋白抑菌谱测定

7.1.13抗菌蛋白对采后辣椒果炭疽病的防治效果测定

7.1.14抗菌蛋白对辣椒炭疽病菌的抑制机制

7.2结果与分析

7.2.1 BS-2菌株在不同培养基上产生抗菌蛋白的测定结果

7.2.2(NH4)2SO4分级盐析结果

7.2.3抗菌蛋白热稳定

7.2.4抗菌物质吸光值测定

7.2.5抗菌蛋白SDS-PAGE和常规PAGE电泳

7.2.6抗菌蛋白MALDI-TOF质谱检测

7.2.7抗菌蛋白HPLC检测

7.2.8 BS-2菌株分泌抗菌肽的抗紫外线活性测定

7.2.9 BS-2菌株分泌抗菌肽的pH值稳定性

7.2.10 BS-2菌株分泌抗菌肽的抑菌谱测定

7.2.12抗菌肽防病机制测定

7.3小结与讨论

8 BS-2菌株发酵条件初步研究

8.1材料与方法

8.1.1不同培养基对菌株生长及抗菌物质分泌的影响测定

8.1.2培养基pH值对菌株生长及抗菌物质分泌影响的测定

8.1.3通气量对菌株生长及抗菌物质分泌影响的测定

8.1.4培养时间对菌株生长及抗菌物质分泌影响的测定

8.1.5培养温度对菌株生长及抗菌物质分泌影响的测定

8.1.6菌量计数

8.1.7菌株外分泌液抗菌活性测定—打孔法

8.1.8菌株培养液对辣椒采后炭疽病的防治作用

8.2结果与分析

8.2.1培养基对菌株生长及抗菌物质分泌影响测定结果

8.2.2 pH值对菌株生长及抗菌物质分泌影响测定结果

8.2.3通气量对菌株生长及抗菌物质分泌影响测定结果

8.2.4温度对菌株生长及抗菌物质分泌影响测定结果

8.2.5培养时间对菌株生长及抗菌物质分泌影响测定结果

8.2.6菌株3号培养液的防病效果

8.3小结与讨论

结论与讨论

1主要研究结果

2特色

3有待进一步研究的问题

4展望

参考文献

附录1：博士期间发表(或投稿)论文及参加课题

附录2：BS-2和BS-1菌株的保藏号、专利申请号及16S rRNA序列GenBank登录号

致谢