柚(Citrus grandis(L.)Osbeck)单染色体AFLP特异分子标记体系的构建

摘要

柚是柑橘属重要的水果之一,然而由于柚遗传背景较复杂,生产周期长,一直以来难以建立精确的物理图谱,这为进行柚基因组学的研究、分子标记辅助育种以及克隆一些重要的园艺性状基因造成了困难。如果能定向获得某一条染色体的一些特异分子标记,建立一个识别各单染色体的分子标记体系,相应就能构建整套的柚单染色体文库,将会大大提高柚遗传图谱绘制的工作效率。本研究以此为依据,运用AFLP分子标记技术筛选琯溪蜜柚单染色体特异分子标记,并取得了如下结果:
　　 1、本试验以瑁溪蜜柚幼胚作为材料,采用玻璃针法显微分离出56条单染色体。通过酶切、接头连接、两轮LA-PCR扩增,建立了56条单染色体文库。经1％琼脂糖凝胶电泳分析,不同单染色体扩增产物的分布有所差异,主要分布在300～2000 bp之间。
　　 2、设计引物组合42对,筛选出L/X和F/I两对引物,对56条单染色体进行AFLP分析,得到清晰的AFLP图谱。经UPGMA聚类分析表明,当相似系数为0.76时,初步将56条单染色体分为11类。
　　 3、通过AFLP多态性分析,筛选出了361条差异片段。选取其中的129条差异片段进行Southern杂交分析,共获得了32个单染色体AFLP特异分子标记。根据特异分子标记在各单染色体中的分布情况,可以明确将56条单染色体中的22条分为九类。
　　 4、测定11个单染色体特异分子标记的序列,经NCBI数据库中的BLAST比对,其中有8个特异分子标记与植物具有较高的同源性,包含3个柑橘属柑橘抗腐根病病毒(CTV)基因,和1个LINE反转录转座子。
　　 本试验通过建立AFLP图谱,对差异片段进行Southem杂交筛选分析,初步构建了柚单染色体AFLP特异分子标记体系。这为进一步建立覆盖率高的全套单染色体文库、定位基因和构建连锁图谱奠定了基础。