铝胁迫下杉木无性系苗若干生理过程及转录组的研究

摘要

铝毒害是全球面临的最大林业问题和环境问题。杉木是我国南方最重要用材树种之一，也正面临着铝的毒害作用。铝毒害的早期症状主要是抑制植物根系伸长，影响植物对水分和养分的吸收，进而影响木材的产量与质量。近年来，涉及杉木铝毒害的生理方面的研究已见报道，由于缺乏基因组序列信息，对这些生理过程背后所蕴含的分子机制尚不清楚，而且结合离子水平和转录水平来研究杉木铝毒害还尚未见报道。鉴于此，本研究以杉木无性系为实验材料，借助非损伤微测技术以及转录组测序等生理生化和分子生物学手段，研究了铝胁迫对杉木无性系地上、地下部分6种矿质元素吸收的影响、铝胁迫对杉木无性系叶绿素荧光特性的影响、铝胁迫对杉木无性系根系4种离子吸收过程的影响以及杉木无性系根系转录组对铝胁迫的响应；挑选了三个代表性的基因，利用实时荧光定量PCR技术，研究了不同铝胁迫时间下这三个基因的表达差异，以期揭示杉木根系响应铝胁迫的分子机制。
　　此外，本研究还从转录组数据库中筛选出与元素相关的差异表达基因，并对其进行了初步的分析。以期为培育杉木耐铝毒能力强的品种提供理论依据和实践基础，扩展和充实杉木铝毒害领域的研究，为南方酸性土壤环境下生长的杉木林业生产实践提供科学依据和理论指导。主要研究结果如下：
　　（1）对地下部分而言，不同铝胁迫浓度对杉木无性系磷、钾、铝含量的影响最大，而不同铝胁迫时间对钙、镁、铁含量的影响最大；对地上部分而言，不同铝胁迫浓度对杉木无性系铝含量的影响最大，而其它元素的影响不明显。
　　（2）不同铝胁迫浓度及不同铝胁迫时间影响了杉木无性系叶片叶绿素荧光参数Fo、Fm、Fv、Fv/Fm的变化。随着铝胁迫浓度的增加及铝胁迫时间的延长，杉木无性系苗叶绿素荧光参数Fo、Fm、Fv、Fv/Fm也随之发生相应的改变。总体上来说，随着铝胁迫浓度的增加及铝胁迫时间的延长，杉木无性系苗叶绿素荧光参数 Fo、Fm、Fv在短时间铝胁迫下均呈现先升高再降低的趋势，随着胁迫时间延长到8 h之后，杉木无性系苗叶绿素荧光参数Fo呈现逐渐增加的趋势，而Fm、Fv则呈现先略有增加再降低的趋势；而对Fv/Fm来说，随着铝胁迫浓度的增加，该参数在短时间（4 h之内）铝胁迫下基本维持在0.85左右，随着铝胁迫时间的进一步延长，Fv/Fm值在低浓度（0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1）的铝胁迫16 h之后才出现降低的趋势，而在高浓度（2 mmol·L-1和4 mmol·L-1）的铝胁迫8 h后就已经出现降低的趋势。
　　（3）不同铝胁迫浓度及不同铝胁迫时间影响了杉木无性系根系对H+、K+、Ca2+和Mg2+离子流的吸收。随着铝胁迫浓度的增加，不同铝浓度胁迫1h后对杉木无性系苗根系H+、K+、Mg2+的影响最大，对Ca2+的影响较小；其中H+由内流逐渐变为外流；K+外流变化幅度较大；Ca2+在1 h铝胁迫后全为内流，在长时间的铝胁迫下由内流变为较大的外流。随着铝胁迫浓度增加，不同铝浓度胁迫32 h后对杉木无性系苗根系H+、Ca2+、Mg2+的影响较大，对K+的影响相对较小；其中H+由内流逐渐变为外流，K+由外流变为较小的内流，Ca2+在32 h铝胁迫后由内流变为外流切外流流速逐渐减小，Mg2+全为外流但是流速变化较大。总之，随着铝胁迫浓度的增加及铝胁迫时间的延长，杉木无性系苗根系 H+由内流逐渐变为外流；K+外流变化幅度较大，长时间的铝胁迫K+外流减小；Ca2+在1 h铝胁迫后全为内流，在长时间的铝胁迫下由内流变为较大的外流；不同浓度的铝胁迫对Mg2+的影响最大。
　　（4）以杉木无性系为实验材料，利用Illumina HiSeqTM2500测序平台对铝胁迫对杉木无性系根系转录组水平的影响进行了研究，分别胁迫1h、4h、8h、16h和32h后取样，提取总RNA，然后将对照组的15个总RNA样品和铝胁迫组的15个总RNA样品分别按照等质量混合构建两个cDNA文库，上机测序后，两个杉木根样品转录组测序共产生24.23 Gb数据，组装获得118761条Transcript和66977条Unigene，分析得到28655个SNP和2439个SSR标记。本试验使用EBSeq软件进行差异表达分析，共获得3246个差异表达基因，统计发现铝胁迫处理组与对照组的杉木根样品相比有1856个上调基因和1390个下调基因发生差异表达。对差异表达基因进行功能、代谢以及调控途径分析，从整体上掌握了铝胁迫相关差异基因的表达模式。结果表明当杉木无性系根系遭受铝毒害时，杉木无性系根中与铝胁迫紧密相关的生物过程、分子功能、细胞组成等都有明显的响应变化。铝胁迫后杉木根中有大量基因发生差异表达，涉及到了氨基酸转运和代谢、碳水化合物的运输和代、无机离子的运输和代谢、次生代谢产物合成、运输和分解代谢等多条代谢途径，同时伴随着能量的代谢，为杉木抵抗铝胁迫带来的损害而进行一系列生理生化反应提供能量。
　　（5）铝胁迫对杉木根中三个基因的表达产生了不同的影响：铝胁迫显著诱导了Cl-TSJT1基因在杉木根中的表达，铝胁迫16 h达到最高表达；铝胁迫8 h显著诱导了ClCa-uptake1基因的表达；铝胁迫显著抑制了ClPt1基因在杉木无性系根中的表达，铝胁迫8 h已经明显抑制ClPt1基因的表达。
　　（6）铝胁迫下杉木根转录组中与钾相关的差异表达基因主要有26个，其中16个上调表达，10个下调表达；与钙相关的差异表达基因主要有13个，其中9个上调表达，4个下调表达；与镁相关的差异表达基因主要有18个，其中12个上调表达，6个下调表达；与铁相关的差异表达基因主要有19个，其中14个上调表达，15个下调表达；与铝相关的差异表达基因主要有33个，其中10个上调表达，23个下调表达；与磷相关的差异表达基因主要有8个，其中5个上调表达，3个下调表达。
　　综上可见，不同铝胁迫浓度及不同铝胁迫时间使得杉木无性系地下部分铝、镁含量增加，钾、铁含量减少，钙的变化不明显；地上部分铝、镁含量增加；钾、铁、钙的变化不明显。而从离子流的变化分析来看，钾、钙与镁离子流的变化情况正好与此结果相符。从转录组学分析结果可知，铝胁迫下杉木无性系根中有大量基因发生差异表达，涉及到无机离子的运输和代谢以及能量的代谢，也进一步说明铝胁迫影响了杉木无性系根系的各种无机离子的吸收与积累。以上研究可为继续开展杉木铝毒害的相关研究提供理论基础。

目录

声明

第一章 综述

1.1 植物铝毒害研究进展

1.2 杉木铝毒害研究进展

1.3 叶绿素荧光动力学技术在植物逆境中的研究进展

1.4 离子流研究进展

1.5 立题依据和研究意义

第二章 铝胁迫对杉木无性系地上、地下部分6种矿质元素吸收的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 铝胁迫对杉木叶绿素荧光特性的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 铝胁迫对杉木根系离子吸收过程的影响

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 杉木根系应答铝胁迫的转录组分析

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.4 小结

第六章 铝胁迫对杉木根中与铝、钙、磷元素吸收与运输相关的三个基因的表达分析

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

6.4 小结

第七章 铝胁迫对杉木根中与元素参与调控相关的差异表达基因的影响

7.1杉木根中与元素参与调控相关的差异表达基因的影响

7.2 讨论

7.3 小结

第八章 结论与展望

8.1 结论

8.2 创新点

8.3 展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文及其他成果

致谢