高效液相色谱测定血浆中氨基酸的方法学研究及临床应用

摘要

目的：
　　 1.建立一种同时测定血浆中色氨酸（tryptophan，Trp）与犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）的高效液相色谱程序波长设计紫外检测方法（HPLC-VWD））。
　　 2.用HPLC-VWD内标法测定正常人和慢性乙肝患者血浆中Trp与Kyn浓度，探讨乙肝患者Trp代谢的变化。
　　 3.建立一种柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FD）同时测定血浆中谷胱甘肽（glutathione，GSH）、半胱氨酸（cysteine，Cys）、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）、半胱氨酰甘氨酸（cysteinylglycine，CysGly）四种硫醇物浓度并对它们各自的总量、还原型和游离型分别定量。
　　 4.用所建立的HPLC-FD法测定正常人和尿毒症患者透析前后GSH、Cys、Hcy和CysGly四种硫醇物的总量、还原型和游离型浓度。利用主成份分析（principal components analysis，PCA）研究尿毒症患者透析前后血浆硫醇物的代谢；利用偏最小二乘法判别分析（partialleast-squares discriminant analysis，PLS-DA）及其载荷图研究血浆硫醇物对尿毒症的诊断能力。
　　 方法：
　　 1.以3-硝基酪氨酸（3-nitro-tyrosine，3-N-Tyr）为内标，采用AgilentHypersil ODS（125.0 mm×4.0 mm，5μm）分离。流动相为醋酸缓冲液（15 mmol/L，pH5.5）：乙腈为94：6（v/V）：流速为0.8 mL/min；柱温：25℃；紫外程序化检测波长：0～4.0 min，360 nm；4.1～5.0 min，302nm。用此方法测定15例正常人和15例慢性乙肝患者血浆中Trp与Kyn。
　　 2.以tris-（2-carboxylethyl）-phosphine（TCEP）为还原剂，N-（1-pyrenyl）maleimide（NPM）为衍生剂，采用Agilent Hypersil ODS（250.0mm X4.0 mm，5μm）分离。流动相A：15 mmol/L醋酸盐溶液，流动相B为乙腈，流动相C为水溶液（300 ml水中加入1ml醋酸和1ml磷酸），梯度洗脱。柱温：25℃，流速：0.5 ml/min，检测波长：激发波长330 nm，荧光波长380 nm，进样量：20μl。用所建立的方法检测28例健康人和29例尿毒症患者血液透析前后血浆中总量、游离型和还原型GSH、Cys、Hcy、CysGly浓度。
　　 结果：
　　 1.Kyn与Trp的保留时间分别为2.9 min和4.4 min，线性范围分别为0.442/μmol/L～18.3μmol/L和3.67μmol/L～470/μmol/L，检测限分别为0.014/μmol/L和0.122μmol/L。Kyn与Trp的日内变异均小于3％，日间变异均小于4％。平均回收率均在92.29％与104.4％之间。慢性乙肝组Kyn/Trp明显高于对照组。
　　 2.GSH、Cys、Hcy和CysGly总量的线性范围分别为2.00～80.0μmol/L，10.0～1500μmol/L，1.00～120μmol/L，3.00～240μmol/L，r为0.9990～0.9999，具有良好的相关性。GSH、Cys、Hcy和CysGly还原型的线性范围分别0.10～8.00μmol/L，1.25～50.0μmol/L，0.01～4.00μmol/L，0.05～6.00μmol/L，r为O.9992～0.9996，具有良好的相关性。最低检测限为0.005～3.0μmol/L。所测硫醇物浓度，日内精密度不超过5.0％，日间精密度均小于9.0％。平均回收率为80％～115％。
　　 3.①尿毒症患者透析前血浆中Hcy、Cys和、CysGly总量、游离和还原型浓度高于正常组，GSH总量、游离和还原型浓度低于正常组。
　　 ②尿毒症患者透析后血浆中各种形式的GSH均较正常组低。总量与游离型Cys透析后降至正常，但还原型Cys仍高于正常。Hcy总量和还原型透析后降至正常但游离型高于正常。透析后各种形式的CysGly浓度均高于正常组。
　　 ③尿毒症患者血浆总量、游离和还原型Cys和Hcy浓度透析后比透析前分别降低。总量Cys和Hcy浓度分别降低了56.5％、53.6％；游离型Cys和Hcy浓度分别降低了81.5％、48.1％；还原型Cys和Hcy浓度分别降低了23.8％、51.9％。血浆总量、游离和还原型GSH和CysGly浓度透析前后无明显变化。
　　 ④主成分得分图显示透析前与透析后和正常组基本区分，透析前相对分散，透析后相对集中且更接近于正常组。
　　 ⑤运用PLS-DA模型诊断尿毒症透析前患者，正确率为93.1％；诊断透析后患者，正确率为82.8％；其总的判对率为89.3％。
　　 结论：
　　 1.本研究建立了一种HPLC-VWD检测法同时测定血浆中Kyn和Trp，采用内标法定量。本方法操作简便，分析时间短，内源性物质干扰小，特异性好，准确度高，适合于临床检验。
　　 2.本文建立了以NPM为衍生剂，TCEP为还原剂的硫醇物柱前衍生荧光检测法。该方法不仅可同时测定tGSH、tCys、tHcy和tCysGly，还可测定他们各自的游离型和还原型。该方法简单、快速、灵敏。
　　 3.本研究发现尿毒症患者硫醇物的代谢发生了紊乱。透析对尿毒症患者硫醇物的代谢紊乱的纠正有明显效果。建立PLS-DA模型能很好的判别透析前患者、透析后患者和正常对照组。载荷图表明rHcy、fHcy和tHcy与透析前的尿毒症患者密切相关且rHcy对尿毒症的诊断更有价值。