携抗菌肽PR39基因的BMSc在膝关节内置物感染中的研究

摘要

目的：⑴利用金黄色葡萄球菌ATCC25923制作兔膝内置物感染模型,并探索该菌致兔膝内置物感染的有效浓度。⑵探讨携抗菌肽PR39基因的BMSc对兔膝关节内置物感染中的作用及其在体内转化情况。
　　 方法：①选取成年健康新西兰大白兔36只,随机平均分为A、B、C三组,将长15 mm的3 mm克氏针作为膝关节内置物,通过兔的股骨髁间窝植入股骨远端。A组在切口缝合后即刻向关节腔内接种0.5 ml1×107CFU的金黄色葡萄球菌,B组接种0.5 ml1×106 CFU的细菌,C组接种0.5 ml1×105CFU的细菌。术后观察伤口情况,同时检测术前、术后1、3、7、14 d血中CRP和ESR的变化情况,术后14d后摄右膝正位X片,并取内置物周围组织病理切片和细菌培养。②选取40只成年健康新西兰大白兔,随机平均分为实验组、对照组,将长15 mm的3 mm克氏针作为膝关节内植物,通过兔的股骨髁间窝植入股骨远端。实验组在植入克氏针前向骨髓腔内接种0.1ml108/ml的携带PR39-GFP融合基因的兔BMSc；对照组则在植入克氏针前向骨髓腔内接种0.1 ml108/ml仅携带GFP基因的BMSc；在关闭关节腔后分别向两组动物的关节腔内注射0.5 ml1x106CFU/ml的金黄色葡萄球菌；并检测术前、术后1、3、7、14 d体温、PMN计数、ESR和血清CRP的变化情况；术后7、14 d取内置物周围组织病理切片和细菌计数,术后14 d摄右膝正位片并取股骨下段做内置物顶出实验。③选取6只成年健康新西兰大白兔,在每只实验兔双侧胫骨结节骨膜下接种0.1ml×105个/ml浓度的携带PR39-GFP融合基因的BMSc,于术后4周取骨膜组织,冰冻切片,行HE染色,在普通显微镜和荧光显微镜下观察组织结构；
　　 结果：⑴手术14 d后,A组死亡1只,剩余11只,B、C两组12只均存活；A组11只,B组9只,C组6只在膝关节周围软组织内形成脓肿,局部皮温明显升高；术后14 d,内置物周围组织培养:A组100％(11/11)感染,B组100％(12/12)感染,C组83.3％(10/12)感染；组织学检测:可见术后感染动物的骨组织内较未感染者明显充血、周围大量的炎性细胞；血清CRP和ESR检测:三组在术后持续保持较高水平(P<0.05),各组间有明显差异(P<0.05)；X线示:所有内置的克氏针位置均良好,术后感染者其边界模糊,股骨下端骨质密度降低,而未感染者其边界清晰,骨密度正常。⑵携抗菌肽PR39基因的BMSc在兔膝关节内置物感染中的作用及其体内转化情况。术后14 d,实验组动物的状况要于对照组,实验动物肛温要低于对照组(P<0.05)；血PMN计数、血清CRP和ESR检测提示:三组在术后均升高,对照组较实验组升高更明显(P<0.05)；组织学检测示:光镜下7 d两组组织脱钙骨切片中都有大量的周围炎性细胞,两组未见明显差异,而14 d可见实验组中是炎性细胞要明显少于对照组；股骨下端细菌计数结果显示:7 d时实验组:3.33±0.28×104CFU/g,对照组:1.58±0.46x105CFU/g；14 d则实验组为6.87±0.85×103CFU/g,对照组为2.25±0.25×105CFU/g；两个时间段内实验组细菌量明显少于对照组(P<0.01),而14 d时更为显著(P<0.0001)；术后14 d X线示:实验组干骺端的骨密度较对照组稍高；顶出实验示:实验组>对照组(P<0.01),提示实验植入物与组界面组织抗剪力要强于对照组。⑶术后4周可见兔双侧胫骨结节可扪及一个骨性突起,质硬,无活动,切开后可见一乳白色组织,可以用手术刀切开。该组织冰冻切片,光镜下可见有骨小梁形成,荧光显微镜可见整个视野大量骨小梁组织散发荧光。
　　 结论：①以15 mm长的3 mm克氏针作为膝关节内置物,经股骨髁间窝植入股骨远端,并于术后接种0.5ml1×106 CFU的金黄色葡萄球菌ATCC25923标准株,可构建膝关节内置物感染的动物模型。②应用携带抗菌肽PR39基因的BMSc可抑制内置物感染所导致的机体炎症反应。③接种到膝关节内置物的周围的携抗菌肽PR39的BMSc可转化为骨组织,有可能减少感染性松动。