钩端螺旋体外膜蛋白血清学诊断价值和CTB-OmpL1疫苗免疫保护作用评价

摘要

背景与目的:
　　以问号钩端螺旋体为代表的致病性钩端螺旋体广泛分布于热带、亚热带和温带地区，引起的人兽共患病称为钩端螺旋体病，简称钩体病。该病是我国重点防控的传染病之一，目前常用诊断钩体病的方法和应用的疫苗存在各自的缺点。近年的研究表明，外膜蛋白是钩体外膜中的重要组成部分，其中多种组分具有致病性和免疫原性。本研究为提高血清学检测的敏感性和特异性，克隆、表达LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8，并以这4种重组蛋白为抗原，建立检测马和狗血清中相应抗体的ELISA和狗血清中相应抗体的LUMINEX法，为研制诊断钩体病的新血清学检测方法奠定实验基础。应用分子生物学方法，构建CTB-OmpL1重组乳酸菌口服疫苗，并利用仓鼠模型评价其免疫保护作用，为研制新型疫苗奠定基础。
　　研究内容与方法:
　　1.采用PCR方法，从钩端螺旋体基因组DNA中分别扩增LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8基因片段，构建原核表达载体LipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21， LigACon4-8-PET28/ Rosetta，大量诱导表达重组菌，运用Ni+NTA及正负离子吸咐柱纯化获得重组蛋白，用Wester blot鉴定。
　　2.以重组蛋白LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8为抗原，建立检测马血清和狗血清中相应抗体的ELISA，用建立的ELISA检测大量临床马血清和狗血清并与传统MAT比较，评价其诊断价值。
　　3.以重组蛋白LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8为抗原，建立检测狗血清中相应抗体的Luminex法，检测大量临床狗血清中相应抗体，并与传统MAT比较，评价其诊断价值。
　　4.用基因工程技术，克隆、表达钩端螺旋体重组蛋白CTB-OmpL1，转入乳酸菌中制备CTB-OmpL1口服疫苗;制备仓鼠钩体感染动物模型，通过该模型评价该口服疫苗的免疫保护作用。
　　结果:
　　1.成功构建了重组表达质粒LipL21-PET28/Rosetta，Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21, LigACon4-8-PET28/Rosetta，双酶切鉴定基因完整，基因测序结果表明与Genebank基因序列基本一致，表达重组菌后获得2-5mg/ml浓度，纯度达90％以上的高浓度的纯化蛋白。Wester blot结果显示重组蛋白能与感染钩体的马和狗血清发生反应。
　　2.用LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原建立的ELISA检测130例MAT阴性和176例MAT阳性马血清，对马血清检测结果，其敏感性分别可达84.66％，77.84％，77.84％，82.39％，特异性达83.85％，92.31％，86.15％，86.15％。
　　3.用LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原与203例MAT阳性，102例MAT阴性狗血清作ELISA检测，其敏感性分别可达99.5％，89.7％，92.6％，97.5％，特异性达84.3％，81.4％，84.3％,84.3％。
　　4.用LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原建立了检测狗血清中相应抗体的Luminex法，检测了203例MAT阳性，20例MAT阴性狗血清，其敏感性分别可达89.66％，75.86％，82.27％，78.33％，特异性达85.0％，80.0％，90.0％，80.0％。
　　5.构建了重组CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗，建立了钩体感染的仓鼠动物模型;口服疫苗免疫仓鼠后可产生较好的免疫保护较果，攻毒后免疫仓鼠存活率可达87.5％。
　　结论:
　　成功表达LipL21，Loa22，LipL32和LigACon4-8，获得高纯度的重组蛋白，均具有良好的抗原性。成功建立了检测马和狗血清中钩体抗体的ELISA，成功建立了检测狗血清中钩体抗体的Luminex法，经检测大量马与狗的临床血清标本，具有较高的敏感性和特异性。钩体重组CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗在仓鼠模型中表现出较好的免疫保护效果。为研制诊断钩体病的新血清学检测方法奠定实验基础。成功构建了CTB-OmpL1重组乳酸菌口服疫苗，经仓鼠模型评价具有较好的免疫保护作用，为研制新型疫苗奠定了基础。

目录

声明

符号说明

摘要

前言

第一部分 四种重组外膜蛋白的表达及纯化

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第二部分 检测马和狗血清中钩体特异性抗体ELISA的评价

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三部分 检测狗血清中钩体特异性抗体LUMINEX的评价

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第四部分 重组CTB-OmpL1乳酸菌疫苗在仓鼠模型中的免疫保护作用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 钩端螺旋体病实验室诊断现状

致谢

攻读博士期间发表的论文