ART1对uPA基因启动子甲基化影响在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用

摘要

目的：探究精氨酸特异性单腺苷二磷酸核糖基化转移酶-1（Arginine-specific mono-ADP-ribosytransferases-1，ART1）对uPA基因启动子甲基化的影响及其在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用。
　　方法：本实验以CT26细胞ART1高表达组（GFP-ART1）、ART1沉默组（GFP-shART1）为实验组，CT26细胞空载体组（GFP-Vector组）、未转染组（Un-transfection组）为对照组，western blot测定不同组别DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达变化，同时，ART1高表达组、ART1沉默组、空载体组及未转染组CT26细胞分别接种于BALB/C小鼠，构建各组别BALB/C小鼠脾脏移植瘤模型并提取各组移植瘤组织蛋白，Western blot测定不同组别DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达变化。DNA甲基化特异性PCR测序法检测不同组别uPA基因启动子甲基化状态变化；免疫共沉淀方法观察CT26细胞ART1高表达组、空载体组及未转染组ART1与DNMT1之间的关系。应用DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-aza-2-dc）处理ART1沉默组CT26细胞，划痕实验和Transwell侵袭实验观察细胞迁移及侵袭能力的变化。BALB/C小鼠脾脏接种ART1基因沉默CT26细胞，腹腔注射5-aza-2-dc，与对照组比较小鼠脾脏移植瘤细胞肝转移情况。采用western blot检测GFP-shART1、GFP-ART1、Un-transfection及GFP-Vector各组肿瘤细胞uPA表达变化，同时检测各组细胞脾脏移植瘤uPA表达变化，并应用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2-dc处理ART1沉默组CT26细胞，western blot方法检测其变化，同时检测5-aza-2-dc处理沉默组与未处理沉默组脾脏移植瘤uPA表达变化。
　　结果：
　　（1）ART1对小鼠结肠癌CT26细胞uPA基因启动子甲基化水平的影响：western blot方法检测ART1高表达组、ART1沉默组、未转染组、空载体组CT26细胞DNMT1表达变化，结果显示，与对照组相比，ART1高表达组DNMT1表达减少，而ART1沉默组DNMT1表达增加（P<0.01）；同时检测各组小鼠脾脏移植瘤蛋白中DNMT1表达变化，结果显示同样的趋势（P<0.01）；采用DNA甲基化特异性PCR测序方法测定uPA启动子甲基化水平在各组的变化，结果显示与对照组相比，ART1高表达组uPA基因启动子甲基化水平降低，而ART1沉默组uPA基因启动子甲基化水平升高。免疫共沉淀结果显示ART1与DNMT1之间尚未发生直接的结合。
　　（2）ART1通过对uPA基因启动子甲基化状态的影响导致其表达变化及其在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭、转移能力的作用：细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测5-aza-2-dc处理组和未处理组CT26沉默细胞迁移及侵袭能力，结果显示与未处理组相比，5-aza-2-dc处理组细胞24h迁移距离明显增高（P<0.01），且降解Matrigel基质胶穿过小室的细胞数明显升高（P<0.01）。采用5-aza-dc处理沉默组CT26细胞构建小鼠脾脏移植瘤模型，观察小鼠肝转移情况，结果显示与未处理组相比，处理组小鼠肝转移模型的肝脏转移结节数（P<0.05）和肝脏重量显著增加（P<0.05）。采用western blot方法检测ART1高表达组， ART1沉默组，未转染组，空载体组CT26细胞uPA表达变化，结果显示与对照组相比，GFP-ART1组uPA表达增加，而GFP-shART1组uPA表达减少（P<0.01）；同时检测各组小鼠脾脏移植瘤蛋白中uPA表达变化，结果显示同样的趋势（P<0.01）；采用5-aza-2-dc处理沉默组细胞后，显示uPA表达增加（P<0.01）；同时western blot方法检测5-aza-2-dc处理组与未处理组CT26沉默细胞移植瘤蛋白结果显示，与未处理组相比，uPA表达显著增加（P<0.01）。
　　结论：ART1沉默能够促进DNMT1表达，促进侵袭转移相关基因uPA启动子高甲基化，引起uPA蛋白表达减少，相反ART1高表达，则使DNMT1表达降低，uPA启动子甲基化程度降低，其蛋白表达增加，同时，抑制DNMT1，uPA基因蛋白表达增加，CT26细胞侵袭、转移能力增强，提示ART1可通过抑制uPA基因启动子甲基化，而促进其表达，从而在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中发挥促进作用。其详细的机制仍有待深入探究。

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前言

第一部分ART1对uPA基因启动子甲基化的影响

1 实验材料

1.1细胞

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 ART1对DNMT1表达的影响

2.3 检测ART1对uPA启动子甲基化水平的影响

2.4 检测DNMT1与ART1之间的相互关系

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 ART1对 DNMT1表达的影响

3.2 ART1对uPA启动子甲基化水平的影响

3.3 ART1和DNMT1之间的关系

4 讨论

第二部分ART1对uPA基因启动子甲基化影响在小鼠结肠癌CT26细胞侵袭转移中的作用

1 实验材料

1.1细胞和实验动物

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2实验方法

2.1 ART1导致uPA基因启动子甲基化状态改变对小鼠结肠癌CT26细胞迁移能力影响

2.2 ART1导致uPA基因启动子甲基化状态变化对小鼠结肠癌CT26细胞侵袭能力影响

2.3 ART1对uPA蛋白及mRNA表达的影响

2.4 5-杂氮-2-脱氧胞苷处理GFP-shART1组CT26细胞对uPA表达的影响

2.5 ART1导致uPA基因启动子甲基化状态变化对 BALB/C小鼠脾脏移植瘤肝转移的影响

2.6 统计学分析

3 实验结果

3.1 ART1导致uPA基因启动子甲基化状态变化对CT26细胞迁移潜能的影响

3.2 ART1导致uPA基因启动子甲基化状态变化对CT26细胞侵袭能力的影响

3.3 ART1导致uPA基因启动子甲基化状态变化对BALB/C小鼠脾脏移植瘤肝转移影响

3.4 ART1对uPA蛋白及mRNA表达的影响

3.5 5-杂氮-2-脱氧胞苷处理GFP-shART1组CT26细胞对uPA表达的影响

4 讨论

全文总结

参考文献

附图

文献综述:DNA甲基化在肿瘤进展中的调控的研究现状

致谢

硕士期间发表论文情况