纳米超声微泡介导NGF基因治疗大鼠急性不完全脊髓损伤

摘要

脊髓损伤（Spinal cord injury SCI）是一种可逆性差、致残率高的中枢神经系统损伤性疾病，其损伤机制十分复杂，目前仍是一大医学难题。脊髓损伤的基因治疗目前尚处于探索阶段，虽然基因治疗脊髓损伤在体外实验和动物实验都取得了重大进展，但仍有许多问题亟待解决，如外源性基因的安全性、转染后表达及其持续性、免疫排斥反应、伦理性问题等。虽然还没有一种基因治疗方法可应用于临床治疗脊髓损伤，但利用目的基因在靶细胞中的表达及其相关特性来保护神经元、促进神经元再生，以及抑制局部胶质瘢痕增生等，最终达到脊髓神经功能恢复，是目前治疗脊髓损伤的研究方向。 近年来，超声靶向微泡破裂（UTMD）技术成为基因转染领域研究的热点，其技术原理主要是体外目的基因或药物与超声微泡结合，然后将载基因或药物超声微泡导入体内，再进行体外超声辐照，利用超声微泡在超声辐照下的产生的空化效应，在细胞膜上形成可逆孔隙，从而使目的基因或药物更容易进入细胞达到靶向治疗目的。 本课题以神经生长因子（NGF）基因作为目的基因，在优化超声微泡制备工艺的基础上，制备出一种高效的载NGF基因的PLGA纳米超声微泡，然后通过超声靶向微泡破裂技术（UTMD）介导NGF基因治疗大鼠急性脊髓损伤，最后采用HE染色、尼氏染色、免疫荧光技术、Westernblot、qRT-PCR、神经元凋亡检测以及神经功能恢复评估等方法观察NGF基因在损伤脊髓组织中的表达情况，神经元再生情况及大鼠神经功能恢复情况，初步评估NGF/PLGA纳米微泡治疗急性不完全脊髓损伤的疗效，以期为治疗脊髓损伤提供一种新的思路和治疗方法。 第一部分、载NGF基因PLGA纳米超声微泡的制备和性能检测 目的：制备一种包载神经生长因子基因（NGF）的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米超声微泡，并研究NGF/PLGA纳米超声微泡的理化性质。 方法：采用双乳化法制备NGF/PLGA纳米超声微泡，观察其形态结构，检测其粒径、电位及分散系数，测定其基因包封率及体外超声辐照下基因释放情况，并在不同浓度梯度及时间梯度下观察其超声显像效果。 结果：NGF/PLGA纳米超声微泡在光学显微镜及电子显微镜观察下呈球形，形态均匀，大小较一致，分散度良好。NGF/PLGA纳米超声微泡的平均粒径为215.3±55.29nm，Zeta电位为-11.3±5.65mV，分散系数为0.027。紫外分光光度法检测其基因包封率为34.33±2.02%；体外超声辐照后12小时GF/PLGA纳米超声微泡基因累积释放率达到52.7%，48小时后基因累积释放率达到62.6%。体外超声显像结果显示NGF/PLGA纳米超声微泡性能稳定，其超声回声强度随着浓度的增加而增强，在48小时内其平均超声回声强度无统计学差异。 结论：本实验所准备的载NGF基因的纳米超声微泡形态均匀、大小一致，分散度良好，包载基因效率高，且具有较好的显像性能，理化性质稳定，是一种理想的基因载体。 第二部分、超声靶向破裂技术介导NGF基因治疗大鼠急性不完全脊髓损伤 目的：探讨超声靶向破裂技术介导NGF/PLGA纳米超声微泡治疗鼠急性不完全脊髓损伤可行性及效果。 方法：构建大鼠急性不完全脊髓损伤模型（Allen法），148只成年雄性SD大鼠随机分为四组：A组：生理盐水（NS）组；B组：NGF+空白微泡（NGF+NBs）组；C组：NGF+超声（NGF+US）组；D组：NGF/PLGA NBs+超声（NGF/PLGA NBs+US）组，每组37只。经尾静脉注射药物后再经相关处理后，在不同时间点采用组织学苏木精和伊红染色（HE）观察脊髓损伤后的病理变化；尼氏染色法（Nissl）观察神经元存活及再生情况；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）染色法检测神经元凋亡情况；采用RT-PCR和Western blotting法检测NGF基因和蛋白的表达情况；通过倒置荧光显微镜观察偶联绿色荧光蛋白的表达情况；最终采用Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB)法评估大鼠神经功能恢复情况。 结果：与其他治疗组相比，NGF/PLGA NBs+US治疗组能明显增加NGF基因的表达，减轻脊髓组织损伤，减少神经元的丢失，能抑制神经细胞凋亡，最终促进脊髓损伤后大鼠神经功能的恢复。 结论：超声靶向破裂技术介导NGF/PLGA纳米超声微泡能有效地将NGF基因转染入损伤脊髓组织，并能促进脊髓损伤的修复。以NGF/PLGA NBs为基础的超声辐照联合基因治疗在治疗脊髓损伤及其他中枢神经系统疾病方面有广阔的应用前景，为脊髓损伤的治疗提供了一种新型、安全的方法。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 载NGF基因PLGA 纳米超声微泡的制备和性能检测

1 实验材料与方法

2 统计学分析

3 结果

4 讨论

参考文献

附图

第二部分 超声靶向破裂技术介导NGF基因治疗大鼠急性不完全脊髓损伤

1 材料与方法

2 统计学分析

3 结果

4 讨论

参考文献

附图

全文总结

文献综述:超声微泡的研究新进展

致谢

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