表没食子儿茶素没食子酸酯对人骨肉瘤细胞的抑制作用及其机制探讨

摘要

目的： 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate， EGCG）对人骨肉瘤细胞的抑制作用，并初步探讨其可能的分子生物学机制。 方法： 骨肉瘤（143B、MG63、SaOS2）三种细胞株，各自采用含0~50μmol/L的EGCG培养基培养后，使用MTT法检测EGCG对三株细胞的增殖活性的影响，集落形成试验检测EGCG对143B细胞集落形成能力影响。应用流式细胞仪和Hoechst染色法分析细胞凋亡情况，采用划痕愈合实验以及Transwell小室法观察细胞迁移能力变化。蛋白印迹法检测细胞凋亡相关蛋白（ Bcl-2、PARP、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP）；增殖相关的蛋白（PCNA）；迁移相关蛋白（MMP-9、Vimentin、E-cadherin）的表达水平变化。采用荧光素酶报告基因系统分析细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活化情况，采用蛋白印迹法检测Wnt/β-catenin信号通路中关键因子β-catenin及其下游靶分子C-myc、CyclinD1、MMP-7蛋白的表达情况。构建骨肉瘤裸鼠模型，采取灌胃给药，观察EGCG对骨肉瘤影响，免疫组化检测瘤体β-catenin、PCNA的表达，以及对肺组织和骨组织HE染色，观察骨肉瘤的侵袭能力。 结果： EGCG处理骨肉瘤细胞后，三株骨肉瘤细胞的增殖能力明显抑制，其中143B细胞的集落形成能力和迁移能力均被明显抑制（P值均＜0.05），且凋亡细胞数明显增加（P＜0.05）。细胞中增殖蛋白PCNA表达降低（P＜0.05）；凋亡相关蛋白Bcl-2、PARP表达降低（P值均＜0.05），Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表达水平均明显上调（P值均＜0.05）；迁移相关蛋白MMP-9、Vimentin表达随浓度的增加逐渐降低（P值均＜0.05），而E-cadherin表达逐渐升高（P＜0.05）；Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、C-myc、CyclinD1、MMP-7、p-GSK-3β的蛋白表达均水平明显下调（P值均＜0.05），GSK-3β蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。此外，EGCG处理组的荧光素酶活性值较未处理组明显下降（P＜0.05）。动物实验结果显示：随着灌胃浓度的提高，瘤体生长速率和体积得到明显抑制（P＜0.05），免疫组化结果显示实验组较对照组β-catenin、PCNA表达降低。HE染色结果显示对照组肺部转移和瘤体对骨组织的侵犯明显，实验组随着EGCG剂量增加肺部转移和对骨组织的侵犯得到明显抑制。 结论： EGCG能抑制骨肉瘤143B细胞的增殖和迁移，促进细胞凋亡，并且这一系列作用可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

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英汉缩略语名词对照

第一部分 表没食子儿茶素没食子酸酯对人骨肉瘤细胞的抑制作用及其机制探讨

1材料和方法

2.实验结果

3.讨论

第二部分 体内实验研究表没食子儿茶素没食子酸酯对人骨肉瘤小鼠肿瘤模型生长的影响

1 材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:骨肉瘤研究进展及展望

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文