rNTP对T7噬菌体DNA聚合酶保真性的影响

摘要

目的： 1.探讨广义错配率重塑DNA聚合酶的保真性。 2.揭示rNTP促进T7 DNA复制的现象及机制。 方法： 1.广义错配率重塑DNA聚合酶的保真性 稳态动力学方法获得gp90 exo?或Dpo4在dG, rG, or8-oxoG三个模板的对侧催化单个dNTP或者单个rNTP插入的kcat和Km参数，采用三种错配的dNTP和四种rNTP的错配率来阐述广义错配率。 2. rNTP促进T7 DNA复制及其机制的探讨 2.1 A家族DNA聚合酶在恒定dNTPs浓度，逐渐增加rNTPs的浓度条件下进行全长延伸反应。 2.2证实rNTP促进T7 DNA复制现象的存在：采用有外切活性的Pol T7代替Pol T7?、变化酶浓度、变化Mg2+浓度和采用其他随机的DNA序列。 2.3采用RNase H1和RNase H2酶切延伸产物确定新合成的双链DNA中核苷酸的种类。 2.4电泳迁移实验检测在dNTPs和（或）rNTPs存在时Pol T7?与DNA形成复合物的情况。 2.5表面等离子共振实验体分析在dNTPs和（或）rNTPs存在时Pol T7?与DNA的亲和力。 结果： 1.广义错配率重塑DNA聚合酶的保真性 对绝大部分DNA聚合酶来说，三种错配的dNTP掺入导致的狭义错配率小于三种错配的dNTP联合四种rNTP的错误掺入导致的广义错配率，广义错配率更能反应DNA聚合酶的保真性。 2. rNTP促进T7 DNA复制 2.1在dNTPs和rNTPs存在的条件下，Pol T7?和KF exo?催化的引物延伸分别在20:1和5:1比例时表现出最大的促进效应，gp90 exo?催化的延伸反应随着rNTP/dNTP比例增加逐渐受到抑制。说明额外存在的适当浓度的rNTPs可以促进T7 DNA复制。 2.2变化引物延伸的条件，在额外的适当浓度rNTPs存在时促进现象重现，并在rNTP/dNTP为20:1时最明显。 2.3在额外的适当浓度rNTPs条件下，Pol T7?催化的的全长延伸产物用RNase H1和RNase H2酶切，结果表明几乎无rNTP的插入，排除由于rNTP直接插入促进DNA复制的可能性。 2.4电泳迁移实验表明，促进现象是由于Pol T7?与DNA形成了更多且更稳定的复合物。 2.5表面等离子共振实验发现rNTP/dNTP为20:1条件下Pol T7?与DNA的亲和力更大。 结论： 1.相比于传统的狭义错配率，广义错配率能更加精准描述DNA聚合酶的保真性。 2.额外存在的适当浓度的rNTPs促进T7 DNA的复制，最大促进效应在rNTP/dNTP为20:1时。促进现象是由于形成的复合物更多且更稳定，同时DNA聚合酶与DNA的亲和力增加，并不是由于rNTP的直接插入所致。

目录

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 广义错配率重塑DNA聚合酶的保真性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 实验结果

2.1 DNA聚合酶纯化

2.2 DNA聚合酶稳态动力学

3 讨论

第二部分 rNTP促进T7 DNA复制及其机制研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 实验结果

2.1 蛋白的表达纯化

2.2 Pol T7?在dNTPs和rNTPs存在下的全长延伸

2.3 A家族DNA聚合酶在dNTPs和rNTPs存在下的全长延伸

2.4 核实rNTP促进T7 DNA复制现象的存在

2.5 RNase H酶切全长延伸产物

2.6 电泳迁移实验

2.7 存在dNTPs和或rNTPs时，Pol T7-和DNA的结合亲和力

3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:rNTP与DNA复制关系的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学位论文