眼镜蛇(Naja naja atra)毒中一种新的穿膜肽(NA-2)的分离纯化及其鉴定研究

摘要

细胞穿膜肽（cell penetrating peptide, CPP）是一类能直接进入真核细胞的肽类分子，能有效地将许多生物活性物质（包括肽类、蛋白质、DNA片断、PNA、siRNA、脂质体和纳米磁性颗粒等）载入到胞质、或胞核、或两者兼之。鉴于CPPs的这种特性，国内外在诸多研究领域如生物膜系统、基因传输系统和药物传输系统等展开了较多的基础和应用研究探索。先后从多种生物体中得到了一些天然的CPP,如Tat蛋白（来自HIV21病毒）、ANTP（为果蝇同源异型转录因子）、HSV21（来自单纯疱疹病毒)、VP22（为蛋白转录因子）及crotamine（来自响尾蛇毒）等等。它们尽管在序列的大小和结构上存在差异，但是都具有细胞跨膜功能,而且表现出跨膜效率高和较小细胞毒性,这些暗示它们是一类潜在的药物载体。
　　目前为止，在蛇毒中只见在响尾蛇毒中报道有CPP,眼镜蛇毒中是否有CPP至今未见有报道，所以本研究首先要确认眼镜蛇毒中是否有 CPP，即我们将粗毒超滤去掉大分子蛋白质而得到多肽，然后将这些肽与异硫氰酸荧光素( FITC)偶联标记，最后对人卵巢癌细胞株 A2780进行跨膜实验（以 Tat48-60作为阳性对照），结果显示有跨膜现象发生，这提示眼镜蛇毒中可能含有CPP。为此，我们采用HPLC从这些肽中分离纯化得到多个主峰，并对这些峰逐一做跨膜实验，显示只有一个主峰有CPP跨膜活性。随后，针对该活性峰做HPLC层析，得到两个单一的肽峰，跨膜实验表明只有第一个肽峰具有跨膜活性，该肽名为NA-2。质谱鉴定得到NA-2的分子量为6,600Da。
　　CCK8毒性实验显示，NA-2终浓度达到100μM时，其对人卵巢癌细胞株A2780仍无细胞毒性，相反对该细胞有一定增殖作用。对不同细胞类型跨膜实验表明， NA-2对多种细胞类型都具有穿膜活性，如人卵巢癌细胞株 A2780细胞、人宫颈Hela癌细胞和人内皮EC细胞等。NA-2的不同浓度（1μM、5μM、10μM）与跨膜行为实验表明存在量效关系；不同孵育时间（2h、6h、10h、24h）与跨膜行为实验表明存在时效关系；不同孵育温度（4℃、10℃、37℃）与跨膜行为实验表明， NA-2进入细胞的量近乎相同，提示在4℃-37℃度范围内对其跨膜活性没有显著影响。
　　总之，本研究首次从我国产的眼镜蛇毒中发现了一个新的CPP即NA-2，其对多种类型细胞具有跨膜活性，且无细胞毒性。该NA-2在跨膜行为上显示量效关系和时效关系，在4℃-37℃度范围内表现出稳定的跨膜活性。这些结果虽然为NA-2的基因传输和药物传送等应用研究奠定了一定基础，但是阐明NA-2跨膜分子机制是关系到NA-2开发应用中一个十分重要的问题，该问题还有待深入研究。

目录

1文献综述

1.1 CPP结构和分类

1.2 CPP跨膜机制

1.3 CPP应用

1.4 CPP应用中存在的问题

2 前言

2.1 研究目的和意义

2.2 主要研究内容

2.3 研究技术路线

3 粗毒中CPP跨膜活性确定

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

4 眼镜蛇毒CPP的分离和纯化

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

5 NA-2跨膜活性的影响研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

6 全文总结

参考文献

作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录、科研情况

致谢

声明