鸡传染性支气管炎免疫胶体金诊断试纸研究

摘要

由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡传染性支气管炎(1B)(简称鸡传支)由丁病毒具有多血清型和多组织嗜性，易丁发生变异而难以防制，成为养鸡业发展的重大阻力。世界各国都非常重视，对其进行了人量研究。目前鸡传支确切诊断依赖于病毒的分离鉴定、血清学检测、分子生物学诊断技术以及电镜技术等。血清学诊断方法包括血凝及血凝抑制实验，神经氨酸酶抑制实验，琼脂糖扩散实验，病毒中和实验，酶联免疫吸附实验，免疫荧光技术等。但这些检测方法由于检测时间较长及检测所需仪器设备较昂贵，多数不适于临床快速检测。因此，新型快速检测鸡传支的方法急需建立，本研究利用免疫胶体金层析技术初步实现了对鸡传支的快速检测，对鸡传支的快速检测具有重要意义。 本研究将鸡传染性支气管炎病毒C型株尿囊液经蔗糖梯度密度离心纯化制取抗原，免疫BALB/C小鼠，将4次免疫后的小鼠脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合，融合率达68.3％。经间接ELISA检测、有限稀释法克隆，筛选出了2株能稳定分泌特异性抗鸡传染性支气管炎抗体的杂交瘤细胞株，依次命名为4D4、4D6，2株单抗的亚类都属丁lgG1，k型。ElISA检测时仅与IBV发生特异性反应，而与其他常见禽类病毒抗原不出现交义反应。获得的单克隆抗体是制备鸡传染性支气管炎免疫胶体金快速诊断试纸条的理想试剂。 用IBV C型鸡传支油乳剂疫苗对兔子进行长期免疫，用间接ELISA方法和琼脂扩散实验(AGP)进行检测，得到了高效价的兔抗IBV多克隆抗体。其效价分别为：ELISA法效价达1∶10万以上，AGF法效价在1∶16-1∶32之间。本实验用获得的单克隆抗体和多克隆抗体建立了鸡传支病毒的胶体金免疫层析快速诊断方法。根据实验需求制备了30 nm的胶体金颗粒，对单克隆抗体(4D4株)最适稳定标记量进行测定，选择100 ml 0.01％金溶胶中的IBV单抗标记量为12 ug/ml。通过最适稳定标记量对单克隆抗体进行标记，成功制备了性能稳定、免疫学活性好的金标IBV单克隆抗体，该金标抗体在4℃保存半年有沉淀或分层现象。 将制备好的金标抗体及经辛酸一饱和硫酸铵法提纯的兔抗IBV IgG用于免疫胶体金诊断试剂条的制备。反应体系将金标抗体固定于玻璃纤维膜上作为显色源，将兔抗IBV IgG包被在硝酸纤维素膜上作为捕获线，羊抗鼠IgG同定硝酸纤维素膜上作为质检线，通过确定各部分最佳喷涂量后制成免疫胶体金诊断试纸条。在检测过程中若待检样晶中含有IBV抗原，则在有效的检测试剂条上捕获线和质检线处均出现一条红线，若待检样品中不含IBV抗原则只在质检线处出现一条红线。通过结果的判定，该快速检测测试条灵敏度可达5 ng/ml。同时本试验用单克隆抗体和多克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA法用丁检测鸡传染性支气管炎病毒，该方法灵敏度可达3.75 ng/ml，标准曲线在3.75ng/ml-500ng/ml范围内线性良好。通过与免疫胶体金诊断方法进行比较，二者检测符合率达90％以上。 本研究成功制备了抗IBV的多克隆抗体及抗IBV共同表何的单克隆抗体，并将其应用在IBV的诊断上，初步制成了鸡传支免疫胶体金诊断试纸条。通过与舣抗体夹心ELISA方法比较研究表明，鸡传支免疫胶体金诊断试纸条具有检测灵敏度高，稳定性好，特异性好，准确度高，重复性好，操作方便等优点，在IBV的快速诊断上具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述

1.1鸡传染性支气管炎诊断的研究进展

1.2免疫胶体金诊断技术的研究进展

引言

研究的目的和意义

研究范围和内容

第三章抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的研制

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

第4章鸡传染性支气管炎免疫胶体金诊断试纸研制

4.1材料

4.2方法

4.3结果

4.4讨论

4.5小结

第五章鸡传染性支气管炎免疫胶体金诊断试纸法与双抗体夹心ELISA法的比较

5.1材料

5.2方法

5.3结果

5.4讨论

5.5小结

第六章全文总结

参考文献

附录：试剂配方

致谢

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