青蒿素生物合成相关基因组织表达谱分析及超量表达ADS基因提高青蒿素含量的研究

摘要

青蒿素(Artemisinin)是从我国药用植物黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)（又名青蒿）中提取的一种含有过氧桥键的新型倍半萜内酯化合物，是治疗脑型疟疾和抗氯喹类疟疾的特效药物，是世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO）推荐的的治疗恶性疟疾的首选药物。每年有数千万剂的临床需求，但是天然青蒿中青蒿素含量较低(0.01％～0.6％，DW)，大大限制了青蒿素的商业化的生产，单从野生青蒿中提取青蒿素远远不能满足市场的需求。化学合成因其成本高、副产物多，毒性大而很难用于工业生产。近年来，随着青蒿素生物合成途径的深入研究以及控制相关反应的关键酶基因的克隆，利用遗传工程定向改造青蒿素生物合成途径成为提高青蒿素含量的有效手段之一。本研究分析了青蒿不同组织中青蒿素合成途径中关键基因的相对表达量，筛选出与青蒿素生物合成密切相关的基因，构建植物高效表达载体，并将其转入青蒿中进行超量表达，研究其对青蒿素生物合成的影响。
　　 本实验采用qPCR技术研究不同组织中青蒿素合成涉及到的7个功能基因，包括HMGR、DXR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR和DBR2的相对表达水平，同时检测对应组织中青蒿素含量，分析各个基因与青蒿素合成之间的关系。青蒿素生物合成上游途径（MVA途径和MEP途径）涉及到的3个关键基因HMGR、DXR、FPS在花中的表达量最高;青蒿素生物合成特有途径涉及到的4个基因ADS、CYP71AV1、CPR、DBR2在根、茎、叶和花中均有表达;ADS表达量在叶中最高，其次为花，茎中表达量最低;CYP71AV1在花中表达量最高，在叶中最低;CPR的表达量在叶中最高;而DBR2在根、茎、叶和花中的表达量相对而言都较低。高效液相色谱-蒸发光散射（HighPerformanceLiquidChromatographywithEvaporativeLightScatteringDetector,HPLC-ELSD）测定各个组织中青蒿素的含量，结果显示叶片中的青蒿素含量最高(0.34±0.077mg·g-1DW)，花次之(0.15±0.017mg·g-1DW)，根(0.06±0.0026mg·g-1DW)和茎(0.06±0.0024mg·g-1DW)中含量较低。青蒿素生物合成中，上游途径中的3个基因在花中的代谢更加活跃。在青蒿素生物合成下游途径的4个功能基因中，ADS在各组织中的表达量与青蒿素含量完全一致，表现为正相关，表明ADS在青蒿素合成中起到重要作用，推测ADS可能是该途径遗传改造的重要靶点。
　　 根据根、茎、叶和花各个组织中7个基因的表达谱研究，发现ADS基因相对表达量与各个组织中青蒿素的含量呈正相关。本研究利用超量表达策略构建了高效植物表达载体p1304-ADS，并将载体导入根癌农杆菌LBA4404，获得了工程菌LBA4404-p1304-ADS。用根癌农杆菌感染青蒿叶片，将ADS基因导入青蒿超量表达;并以潮霉素(10mg·L-1)进行抗性筛选获得抗性芽，待抗性长至2-3cm将其转至MS+NAA(0.05mg·L-1)+Cef(200mg·L-1)培养基上继续筛选并诱导生根，多次继代培养。农杆菌除菌完全后对抗性植株进行基因组PCR检测，在转基因青蒿中能跨35S启动子够检测到ADS(636bp)，而非转基因青蒿中不能检测到ADS。对检测的阳性植株在MS+NAA(0.05mg·L-1)诱导培养基上进行生根培养;待植株长到5cm时转到品氏托普育苗培养基中炼苗。4月中旬下地进行田间实验，现第一花蕾时对种植的青蒿进行取样，并以同期种植的非转基因青蒿作为对照，石油醚萃取法提取青蒿素，HPLC-ELSD法测定青蒿素含量。获得的5个独立转化的转ADS基因青蒿进行青蒿素含量测定，以非转基因青蒿为对照。检测结果显示，非转基因青蒿中青蒿素含量为0.96mg·g-1(DW)，在转ADS基因黄花中有3个株系(A41、A48、A32)的青蒿素的含量有明显的提高，而且与对照组相比其差异性达到了显著水平(p＜0.01)，A164株系青蒿素含量与对照相比有小幅的降低，A26株系青蒿素并没有显著的提高。所获得的5个株系中青蒿素的含量高低顺序为A32＞A48＞A41＞A26＞CK＞A164。164、A26、A41、A48和A32这5个转基因株系中青蒿素干重含量分别为0.73±0.003mg·g-1、1.13±0.080mg·g-1、2.16±0.285mg·g-1、2.56±0.100mg·g-1、2.67±0.285mg·g-1，其中A32青蒿素含量最高为2.67mg·g-1，是非转基因青蒿的2.7倍。在青蒿中超量表达内源基因ADS能提青蒿素含量。通过该转基因方法获得的转基因青蒿新品系可以作为产业化生产青蒿素的原始材料，解决青蒿素紧缺的问题，满足市场上对青蒿素的大量需求。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 背景概况

1．2 青蒿概况

1．3 青蒿素及其衍生物

1．3．1 青蒿素的结构及性质

1．3．2 青蒿素类药物的药理作用研究进展

1．3．3 青蒿素的分布与储存部位

1．3．4 影响青蒿中青蒿素含量的因素

1．4 青蒿素的生物合成途径及关键酶

1．4．1 青蒿素生物合成上游途径

1．4．2 青蒿素生物合成下游途径

1．5 应用生物技术生产青蒿素

1．5．1 植物细胞与组织培养生产青蒿素

1．5．2 微生物生产青蒿素

1．5．3 遗传工程技术提高青蒿中青蒿素的含量

第2章 绪论

2．1 研究目的与意义

2．2 研究范围和内容

2．3 技术路线

第3章 实验材料与试剂

3．1 实验材料

3．2 质粒和菌株

3．3 仪器和设备

3．4 试剂盒及试剂

3．5 自配试剂

3．6 本实验室常用抗生素的配置

第4章 方法与步骤

4．1 常规方法介绍

4．1．1 青蒿RNA的提取

4．1．2 荧光定量cDNA合成

4，1．3 引物设计

4．1．4 荧光定量引物最适退火温度筛选

4．1．5 标准曲线的制作及扩增效率的检测

4．1．6 qPCR扩增体系及反应条件

4．1．7 农杆菌感受态细胞的制备与转化

4．2 SDS法小量抽提青蒿基因组DNA

4．3 青蒿再生体系的建立

4．4 青蒿的遗传转化

4．4．1 工程菌的活化

4．4．2 工程菌LBA4404-p1304-ADS对青蒿的叶盘法转化

4．5 抗性植株的检测

4．6 青蒿素提取与HPLC检测

第5章 结果与分析

5．1 各基因的标准曲线

5．2 基因在不同组织中的表达

5．2 青蒿的遗传转化、炼苗及田间种植

5．3 转基因青蒿的检测

5．4 青蒿素含量的测定

5．4．1 青蒿素的HPLC-ELSD标准曲线

5．4．2 青蒿素的标准品和样品的HPLC图谱

5．4．3 青蒿素含量检测

5．5 结论与分析

参考文献

附录

致谢

在校期间发表的文章