家蚕丝腺特异表达的bHLH转录因子Bmsage和Bmdimm的功能研究

摘要

家蚕丝腺是一种高度特异化的器官，能够高效特异地合成丝蛋白，根据其结构可以分为前部、中部和后部丝腺。前部丝腺不合成蛋白，中部丝腺合成丝胶蛋白，后部丝腺合成丝素蛋白，丝素蛋白分为丝素重链蛋白（fib-H）、丝素轻链蛋白(fib-L)和P25蛋白，它们按6∶6∶1组合形成多聚体蛋白。在幼虫各龄眠期和变态期，家蚕只合成少量或不合成丝蛋白，进入五龄盛食期，丝素和丝胶基因的转录水平大大提高，丝蛋白随即被大量合成。研究表明，丝蛋白基因的表达主要是在转录调控水平进行的，目前研究学者已经在家蚕丝腺中发现了大量的转录因子，这些转录因子广泛的参与丝腺器官的发育、丝蛋白基因的转录以及丝腺细胞的凋亡等生命过程。家蚕基因组数据和基因芯片数据的公布，为研究家蚕丝腺特异转录调控因子提供了信息平台。本研究根据之前发现的两个在家蚕丝腺特异表达的并且含有bHLH结构域的转录因子—Bmsage和Bmdimm，采用克隆、表达、RT-PCR、western blot等技术对Bmsage和Bmdimm生物进化关系、转录水平以及蛋白质水平的组织表达模式进行了分析和研究。同时，在细胞水平探讨了它们在丝素重链蛋白基因的转录调控中的作用并且从分子生物学水平探讨了保幼激素在家蚕丝蛋白合成过程中的作用，获得的主要研究结果如下:
　　1.家蚕Bmsage和Bmdimm原核表达及表达模式分析
　　进化分析发现，Bmsage同果蝇sage和小鼠Mesp等因子具有较高的相似性;Bmdimm同果蝇dimmed和小鼠Mist等因子具有较高的相似性。因此，我们认为Bmsage属于bHLH家族中的Mesp亚家族;而Bmdimm则同Mist因子一样属于Atonal亚家族。另外，将其克隆并原核表达了Bmsage和Bmdimm重组蛋白，其中Bmsage在37℃温度下以包涵体形式表达，Bmdimm全长在该表达系统下不表达。对Bmdimm进行多种方式的截断，发现第一种截短形式(187-636 aa)的蛋白以可溶蛋白形式在上清表达。通过各种蛋白柱的分离纯化，获得Bmsage和Bmdimm的纯化蛋白。用这两个纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，效价均达到了512 k而且纯度均在95％以上，表明可以用于后续相关实验。组织表达分析表明:在转录水平上，Bmsage和Bmdimm在家蚕丝腺组织中表达，Bmdimm在中肠中存在少量表达，这与家蚕芯片表达谱分析的数据基本一致。进一步分析发现在前部、中部和后部丝腺中均能检测到Bmsage和Bmdimm的转录本存在;在蛋白质水平上，Bmsage和Bmdimm只存在于丝腺组织中，而且只在中部和后部丝腺，其中Bmdimm在后部丝腺的量明显高于中部丝腺。不同时期RT-PCR分析表明，Bmsage和Bmdimm的表达从四眠中后期开始逐渐升高，到五龄6-7天达到最高，随后到成熟期表达逐渐降低直到化蛹表达终止，这一表达模式与丝素重链基因(fib-H)相似。通过对低丝量品种大造和高丝量品种872丝腺中Bmsage、Bmdimm和fib-H的转录本qRT-PCR定量分析发现，Bmsage和Bmdimm基因在872的后部丝腺表达量显著高于大造，而且Bmdimm基因在后部丝腺表达量同样高于中部丝腺，而872品种后部丝腺中fib-H的转录本约是大造的3倍，结果表明Bmsage和Bmdimm极有可能参与fib-H基因的转录调控。
　　2.Bmsage对家蚕丝素重链基因的转录调控
　　转录因子一般是协同其它因子对下游靶标基因的表达进行调控。Western blot分析发现，家蚕丝腺fork head因子SGF1和Bmsage一样均在家蚕中部和后部丝腺表达，为证实Bmsage是否与SGF1存在相互作用，利用体外重组蛋白进行了far-western blot和ELISA实验，结果表明，Bmsage能够在体外与SGF1相互作用。为进一步验证该结果，在家蚕胚胎细胞系中进行了免疫荧光和免疫共沉淀(co-IP)实验，结果显示与体外实验一致，表明Bmsage和SGF1能够相互作用。凝胶阻滞实验(EMSA)结果显示，重组表达的Bmsage和SGF1蛋白在体外孵育后，通过SGF1结合到fib-H启动子上的近端区A和B位点上。fib-H启动子缺失实验表明A和B位点是SGF1对fib-H的表达调控位点，这些表明Bmsage和SGF1蛋白形成复合物，通过SGF1结合到A和B位点上调控fib-H的表达。
　　3.Bmdimm对家蚕丝素重链基因的转录调控
　　为分析fib-H基因的转录调控机制，利用家蚕基因组数据库下载其转录起始位点上游约1000 bp区域，预测分析显示这段启动子区域中除了存在近端区和远端区的A、B、C、D和E位点外，还存在着E-box、βFTZ-F1和POU等转录结合位点。染色质免疫共沉淀实验(ChIP)结果显示，Bmdimm能够与fib-H启动子区域中的E-box(CAAATG)元件结合，EMSA实验进一步验证了该结果。Bmdimm除了与CAAATG元件结合外还可以与其它几种形式的E-box结合，如CAATTG、CAACTG等，这表明Bmdimm结合位点并不是唯一的，暗示着可能参与其它基因的转录调控，如fib-L和P25等。定点突变实验结果显示Bmdimm碱性区域保守的第113位精氨酸是结合CAAATG元件的关键位点。启动子缺失实验显示，缺失了该E-box位点的fib-H启动子在过表达Bmdimm后的活性几乎没有变化而正常的启动子活性显著增加，表明Bmdimm可以通过该E-box位点调控fib-H基因的表达。bHLH转录因子可以通过其bHLH结构域相互作用形成同源或异源二聚体，然后通过二聚体中的一段保守碱性区域与特定的DNA序列进行结合进而调控靶标基因的表达。为证实Bmdimm是否与Bmsage存在相互作用，利用体外重组蛋白进行了far-westem blot和ELISA实验，结果表明，Bmdimm在体外能够与Bmsage相互作用。为进一步验证该结果，在家蚕胚胎细胞系中进行了免疫荧光和co-IP实验，结果显示与体外实验一致，表明Bmdimm和Bmsage能够相互作用。为了分析Bmdimm的调控网络，预测分析了Bmdimm基因转录起始位点上游约2000 bp的启动子区域，结果发现存在fork head可能的反应元件，暗示SGF1在Bmdimm基因的表达中可能起着调控作用。EMSA实验表明SGF1可以与fork head元件结合，同时在细胞中过表达SGF1后，Bmdimm启动子活性明显升高，而且qRT-PCR结果显示Bmdimm在细胞中的表达量也明显提高。
　　4.保幼激素对家蚕丝素基因的调控
　　通过对Bmdimm基因启动子预测得到多个与昆虫激素相关的可能反应元件，包括Kr，E-box，BR-C，E74A和FTZ-F1，这些元件已被证实可能是昆虫激素信号传导途径中的重要转录因子的结合元件，调控下游目的基因的表达，尤其Kr位点是保幼激素早期响应基因Kr-h1的潜在结合元件，暗示着Bmdimm基因可能受到保幼激素信号途径的调控作用。用保幼激素类似物(JHA)处理五龄早期家蚕发现，家蚕五龄龄期经过延长2-3天;qRT-PCR结果显示与对照相比fib-H基因及其调控因子Bmdimm基因的表达量在前期有所下降，随着龄期发育逐渐升高，并出现延时表达。同时发现，JH早期反应基因BmKr-h1在前期表达量升高，随后随着JH受体表达降低而降低，到五龄末期也出现延时表达。丝腺体外培养结果显示BmKr-h1的表达趋势与Bmdimm类似。在家蚕BmE细胞系中，用不同浓度的JHA诱导不同时间发现Bmdimm具有JH浓度和诱导时间依赖性。BmKr-h1位于JH受体BmMet2的下游响应JH的诱导表达，而且过表达BmKr-h1后Bmdimm的表达量提高而蜕皮激素初级反应基因Brc-Z2和Brc-Z4的表达受到抑制，表明在家蚕细胞系中存在激素信号传导途径。利用RNAi技术在细胞中干涉BmKr-h1后，Bmdimm和fib-H不再响应JH的诱导，表明BmKr-h1位于Bmdimm上游调控其表达。该结果为进一步阐明昆虫激素对家蚕丝蛋白合成的调控作用提供了线索。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 家蚕丝腺组织及生理功能

1．2 家蚕丝素蛋白基因的结构

1．2．1 蚕丝的组成

1．2．2 丝素重链

1．2．3 丝素轻链

1．2．4 P25

1．3 家蚕丝素蛋白基因的转录调控研究进展

1．3．1 丝素蛋白重链基因的转录调控

1．3．2 丝素蛋白轻链基因的转录调控

1．3．3 P25基因的转录调控

1．4 bHLH转录因子的研究进展

1．4．1 bHLH转录因子的结构及分类

1．4．2 bHLH转录因子功能

1．5 家蚕bHLH转录因子的研究进展

1．6 昆虫保幼激素信号传导途径

1．6．1 昆虫保幼激素及其可能受体

1．6．2 保幼激素在家蚕丝腺中的作用

1．7 真核生物转录调控的研究方法进展

第二章 引言

2．1 研究背景及意义

2．2 拟解决问题和研究的主要内容

2．3 研究思路与技术路线

2．3．1 研究思路

2．3．2 技术路线

第三章 家蚕Bmsage和Bmdimm原核表达及表达模式分析

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要溶液及配制

3．2．4 生物进化分析

3．2．5 RNA的提取

3．2．6 PCR

3．2．7 目的片段的回收

3．2．8 目的片段与载体的连接

3．2．9 转化

3．2．10 阳性克隆的筛选和验证

3．2．11 表达质粒菌株的诱导

3．2．12 蛋白表达形式的鉴定

3．2．13 SDS-PAGE电泳

3．2．14 目的蛋白的提取

3．2．15 目的蛋白的纯化

3．2．16 免疫印迹

3．2．17 RT-PCR

3．2．18 荧光定量PCR

3．3 结果与分析

3．3．1 系统进化分析

3．3．2 Bmsage和Bmdimm原核表达载体的构建

3．3．3 Bmsage和Bmdimm原核表达纯化及多克隆抗体制备

3．3．4 抗体效价

3．3．5 五龄三天不同组织RT-PCR分析

3．3．6 五龄三天不同组织western blot分析

3．3．7 不同时期家蚕丝腺组织的Bmsage和Bmdimm的表达分析

3．3．8 不同产丝品种丝腺中的Bmsage和Bmdimm的表达分析

3．4 讨论

3．4．1 Bmsage和Bmdimm原核表达纯化及多克隆抗体制备

3．4．2 Bmdimm和Bmsage的组织表达特性分析

3．4．3 Bmdimm和Bmsage的时期表达特性分析

第四章 Bmsage对家蚕丝素重链基因的调控

4．1 前言

4．2 材料和方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 主要仪器

4．2．3 主要溶液及配制

4．2．4 载体构建

4．2．5 SDS-PAGE

4．2．6 凝胶阻滞实验

4．2．7 far-western blot

4．2．8 ELISA

4．2．9 免疫共沉淀

4．2．10 免疫荧光

4．2．11 重组蛋白纯化

4．2．12 细胞培养与转染步骤

4．2．13 细胞的裂解与荧光素酶活性的测定

4．2．14 核蛋白的抽提

4．2．15 Western blot

4．3 结果与分析

4．3．1 SGF1表达载体构建、原核表达纯化及多克隆抗体制备

4．3．2 SGF1在家蚕五龄三天不同组织中的分布

4．3．3 Bmsage与SGF1相互作用

4．3．4 fib-H启动子A和B位点EMSA分析

4．3．5 fib-H基因启动子缺失分析

4．4 讨论

第五章 Bmdimm对家蚕丝素重链基因的调控

5．1 前言

5．2 材料和方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 主要仪器与试剂

5．2．3 主要溶液及配制

5．2．4 启动子序列分析

5．2．5 表达载体构建

5．2．6 染色质免疫共沉淀

5．2．7 qRT-PCR

5．2．8 核蛋白的抽提

5．2．9 凝胶阻滞实验

5．2．10 Far-western blot

5．2．11 ELISA

5．2．12 免疫共沉淀

5．2．13 免疫荧光

5．2．14 细胞培养与转化

5．2．15 荧光素酶活测定

5．2．16 定点突变

5．3 结果与分析

5．3．1 fib-H基因启动子调控元件预测

5．3．2 染色质免疫共沉淀

5．3．3 fib-H启动子E-box位点缺失分析

5．3．4 fib-H启动子E-box的EMSA分析

5．3．5 Bmdimm点突变分析

5．3．6 Bmdimm与Bmsage相互作用

5．3．7 Bmdimm和Bmsage启动子元件分析

5．3．8 Bmdimm和Bmsage启动子SGF1结合的顺式元件EMSA分析

5．3．9 SGF1上调Bmdimm和Bmsage的表达

5．4 讨论

第六章 保幼激素对家蚕丝素重链基因的调控

6．1 前言

6．2 材料和方法

6．2．1 实验材料

6．2．2 主要仪器与试剂

6．2．3 主要溶液及配制

6．2．4 dsRNA合成

6．2．5 组织离体培养

6．2．6 总RNA提取

6．2．7 qRT-PCR

6．2．8 BmKr-h1和BmMet2真核表达载体构建

6．2．9 细胞培养与保幼激素类似物处理

6．3 结果与分析

6．3．1 家蚕五龄幼虫保幼激素类似物处理以及Bmdimm的表达

6．3．2 家蚕丝腺组织离体培养

6．3．3 保幼激素类似物对BmKr-h1表达的影响

6．3．4 在家蚕胚胎细胞中JHA对Bmdimm表达的影响

6．3．5 BmKr-h1位于BmMet2下游上调Bmdimm的表达

6．4 讨论

第七章 综合与结论

参考文献

附录

论文的创新点

论文发表与参加课题

致谢