限制性内切酶DpnⅠ在大肠杆菌W3110菌株中的克隆、表达纯化及其功能研究

摘要

基因编辑技术在基因治疗、药物制备、农业生产、环境保护、濒危动物救助等方面起着非常关键的作用，目前CRISPR/Cas9这一新兴编辑技术基于其高效、方便，快速等优点，已经得到了广泛的应用。该技术已经被成功运用于斑马鱼，拟南芥，酿酒酵母等生物的基因编辑。但是，有关在大肠杆菌的运用不是很成熟，本文首先拟通过该技术，对大肠杆菌中的相关基因进行快速、高效编辑。
　　该技术利用一个二元载体系统：Cas蛋白偶联λ-Red重组酶的系统和一个指导切割的sgRNA偶联同源臂donor的载体系统。该技术操作步骤如下：首先，通过PCR重组技术原理，获得需要编辑的目的基因在重组修复过程中的同源序列；然后将指导切割目的编辑基因20bp序列扩增到含sgRNA（cRNA和transcRNA的二元复合物）的载体上，并将以上同源序列通过PCR重叠的方式构建到含20bp的载体上；最后将含λ-Red重组酶的cas9质粒系统和含20bp的指导序列又含同源序列的重组载体质粒系统同时转化到大肠杆菌不同类型的感受态中，并在含抗生素的平板上筛选，挑取菌落进行 PCR鉴定，并将扩增的条带进行测序验证，待测序结果正确之后，消除pcas9质粒和含sgRNA的载体质粒，最后得到了含缺失基因的大肠杆菌菌株。由于脱氧腺苷酸甲基化酶（Dam）对DNA复制和蛋白表达的调节以及在DNA错配修复中发挥很大的作用，首先，尝试利用该新型基因编辑技术构建大肠杆菌不同菌株里dam基因的敲除系统，但是很惊奇的发现缺失dam基因仅能在大肠杆菌W3110和DH5α菌株中被筛选到PCR鉴定阳性菌落，且扩增条带经测序得到确定的缺失该部分DNA序列的菌株，而在大肠杆菌BL21DE3中筛选不到阳性；接着为进一步验证在大肠杆菌不同菌株中的编辑效率，对大肠杆菌中1,6-二磷酸果糖激酶fbp、丝氨酸乙酰转移酶cysE和二氢硫辛酸脱氢酶IpdA基因进行敲除以及将绿色荧光蛋白基因gfp敲入到大肠杆菌基因组中，同样地，基因的敲除、敲入系统几乎无法在大肠杆菌BL21DE3工作，但是同样能在大肠杆菌W3110和DH5α菌株中筛选到阳性。
　　脱氧腺苷酸甲基化酶的作用过程：它首先识别DNA复制过程产生的未甲基化新生链的5'-GATC-3'DNA序列，然后对其中的腺嘌呤进行甲基化，最后使得新生链与模板链一起具有甲基化的修饰特征。而限制性内切酶DpnⅠ刚好又是识别5'-GATC-3'序列中甲基化的腺嘌呤并对其进行切割，所以就能在缺失dam基因的菌株中表达得到DpnⅠ蛋白。并且除商业的 DpnⅠ的运用，并没有关于该蛋白酶的表达纯化的具体报导，大量得到DpnⅠ蛋白显得非常重要。将构建好的 pGEX-6p-2-his-DpnⅠ质粒转化到已使用CRISPR/Cas9技术敲除dam基因的W3110菌株中，从而获得该限制性内切酶。
　　本实验成功构建了CRISPR/Cas9编辑大肠杆菌不同菌株中基因的敲除系统，发现了在编辑同一基因时在不同的大肠杆菌菌株中不同的编辑效率，为CRISPR/Cas9技术在大肠杆菌的运用提供了新的认识和奠定了一定的理论基础；并在缺失 dam基因的重组W3110菌株中表达纯化得到了商业价值比较高的限制性内切酶 DpnⅠ，为广泛获得该酶提供了实验依据。

目录

声明

1.文献综述

1.1 cas9蛋白的概念以及基本原理

1.2 CRISPRs/Cas系统的组成

1.3 CRISPR-Cas免疫系统的过程

1.4 CRISPR/Cas9系统缺口的修复方式：同源重组

1.5 CRISPR/Cas9系统的应用

1.6 Dam甲基化酶

1.7 CRISPR-Cas免疫系统在大肠杆菌不同菌株的编辑效率

1.8限制性内切酶以及DpnⅠ

2.引言

3. 材料与方法

3.1材料

3.2方法

4.结果与分析

4.1dam基因敲除

4.2大肠杆菌cysE、fbp、IpdA基因的敲除以及gfp基因的敲入

4.3重组DpnⅠ的表达

4.4重组DpnⅠ的纯化以及验证

4.5重组DpnⅠ的活性检测

5.讨论与总结

5.1 CRISPR/Cas9-Red system在大肠杆菌的有效编辑

5.2 W3110（dam-）菌株中表达纯化到高质量DpnⅠ

5.3重组DpnⅠ具有较高活性

参考文献

附录

英文缩略词表

本论文使用到的引物及其信息表

基因编辑的双质粒系统以及编辑原理图

致谢

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