何首乌提取物防治糖皮质激素诱发雌性大鼠骨质疏松的作用及机制研究

摘要

【目的】 课题组前期实验发现何首乌及其提取物的防治骨质疏松作用，已申请国家发明专利。并初步探讨了何首乌主要成分大黄素和二苯乙烯苷的作用，发现大黄素与二苯乙烯苷能促进骨髓基质干细胞(MSCs)向成骨细胞方向分化，前者抑制MSCs向脂肪细胞方向分化，后者作用可能与调控Wnt信号通路有关。怎样可以获得含更多抗骨质疏松活性成分的何首乌提取物呢？在活性指导下制得的何首乌提取物是否可以增加以骨形成下降为主的糖皮质激素性骨质疏松动物模型的骨量呢？如果有效，其作用机制可能是什么？基于以上问题，本课题在活性指导下进行何首乌提取并观察其对糖皮质激素致大鼠骨丢失的预防作用，并初步探讨其作用机制，为糖皮质激素性骨质疏松症(Glucocorticoid-induced Osteoporosis，GIO)治疗提供新思路，并为何首乌抗骨质疏松新用途的开发提供初步实验数据。 【方法】 1.何首乌提取工艺及含量测定 取何首乌干燥根块加75%乙醇加热回流提取，经环己烷萃取，真空干燥浓缩成何首乌总提取物脂溶性部分(PMRF)。PMRF溶于水经D101大孔树脂吸附，后依次经水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脱，收集30%洗脱液浓缩制得何首乌30%乙醇洗脱部位(PMR30)。用HPLC法检测样品中二苯乙烯苷与结合蒽醌的含量。 色谱柱：Syncronis RP-C18，柱温：25℃；流动相：0~20 min10%~30%甲醇-水(1‰ H3PO4)，20~40 min30%~50%甲醇-水(1‰ H3PO4)，40~60 min50%~85%甲醇-水(1‰ H3PO4)，60~80 min85%~100%甲醇-水(1‰ H3PO4)梯度条件；流速：1 ml/min；检测波长：320 nm，254 nm。 2.何首乌防治糖皮质激素性大鼠骨质疏松的作用 6月龄SD雌性大鼠100只，按体重随机分成10组。基础组、空白对照组、泼尼松模型组(GC，6 mg.kg?1.d?1)、PMR30高剂量组(GC+PMR30400 mg.kg?1.d?1)、PMR30中剂量组(GC+PMR30200 mg.kg?1.d?1)、PMR30低剂量组(GC+PMR30100 mg.kg?1.d?1)、PMRF高剂量组(GC+PMRF400 mg.kg?1.d?1)、PMRF中剂量组(GC+PMRF200 mg.kg?1.d?1)、PMRF低剂量组(GC+PMRF100 mg.kg?1.d?1)、阳性对照组(GC+罗盖全0.045μg.kg?1.d?1)。连续灌胃给药120天，每周称体重1次。实验结束前第14、13天和第4、3天，分别给予钙黄绿素进行体内荧光标记。实验结束时，大鼠心脏抽血，分离血清进行生化指标检测。分离并记录大鼠胫前肌、胸腺、肾上腺、肾脏、子宫、卵巢、肝脏重量。取右侧股骨进行Micro-CT、骨密度与生物力学检测；第四腰椎进行Micro-CT、骨密度检测；第五腰椎进行生物力学检测；左侧胫骨进行骨组织形态计量学检测；右侧胫骨上段进行 HE染色；左侧股骨进行免疫蛋白印迹法检测DKK1、WIF1、SFRP4蛋白表达。 【结果】 1.何首乌有效成分含量测定 何首乌有效成分含量测定结果：PMR30中二苯乙烯苷与结合蒽醌含量分别为9.20%和0.15%，PMRF中二苯乙烯-苷与结合蒽醌含量分别为2.23%和0.03%。 2.何首乌防治糖皮质激素性大鼠骨质疏松的作用 (1)体重、软组织重量及血清生化指标的变化情况：与空白对照组相比，泼尼松组大鼠出现体重下降、免疫器官(胸腺与肾上腺)与骨骼肌(胫前肌)萎缩现象(P<0.05)。与泼尼松组相比，罗盖全组大鼠卵巢重量增加(P<0.05)。与泼尼松组相比，PMR30中、低剂量组及PMRF高剂量组大鼠出现体重增加、免疫器官与骨骼肌重量增加(P<0.05)。各组之间血清生化指标的变化无统计学意义。 (2) Micro-CT三维形态计量学变化情况：与基础组相比，空白对照组大鼠股骨远端松质骨的骨体积分数(BV/TV)、连接密度(Dens)、骨小梁数量(Tb.N)增加(P<0.05)，骨小梁分离度(Tb.Sp)减少(P<0.05)。与空白对照组相比，泼尼松组大鼠股骨远端与腰椎松质骨的BV/TV、Tb.N下降(P<0.05)。与泼尼松组相比，罗盖全组大鼠股骨远端与腰椎松质 BV/TV、Dens、Tb.N增加(P<0.05)，Tb.Sp减少(P<0.05)。与泼尼松组相比，PMR30中、低剂量组及PMRF高剂量组大鼠股骨远端与腰椎松质骨的BV/TV上升(P<0.05)，且PMRF中、低剂量组大鼠腰椎松质骨BV/TV上升(P<0.05)。 (3)骨矿含量与骨密度变化情况：与空白对照组相比，泼尼松组大鼠股骨远端骨密度(BMD)下降(P<0.05)。与泼尼松组相比，罗盖全组大鼠股骨远端BMD上升(P<0.05)。与泼尼松组相比，PMR30及PMRF各剂量组大鼠股骨与腰椎的BMD、骨矿含量(BMC)变化无统计学意义。 (4)骨生物力学变化情况：与基础组相比，空白对照组大鼠股骨与腰椎生物力学参数增加(P<0.05)。与空白对照组相比，泼尼松组大鼠股骨与腰椎生物力学参数下降(P<0.05)。与泼尼松组相比，罗盖全组大鼠腰椎生物力学参数上升(P<0.05)。与泼尼松组相比，PMR30与PMRF各剂量组大鼠股骨与腰椎的生物力学参数变化无统计学意义。 (5)胫上段松质骨二维形态计量学变化情况：与基础组相比，空白对照组大鼠骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、Tb.N、骨形成率(BFR/TV)增加(P<0.05)，成骨细胞周长百分数(%Ob.S.Pm)减少(P<0.05)。与空白对照组相比，泼尼松组大鼠%Tb.Ar、荧光周长百分数(%L.Pm)、骨矿化沉积率(MAR)、BFR/TV、%Ob.S.Pm下降(P<0.05)、破骨细胞周长百分数(%Oc.S.Pm)与平均每毫米破骨细胞数量(Oc.N)上升(P<0.05)。与泼尼松组相比，罗盖全组大鼠%Tb.Ar、BFR/TV增加(P<0.05)，%Oc.S.Pm减少(P<0.05)。与泼尼松组相比，PMR30高剂量组大鼠%L.Pm、BFR/BS上升(P<0.05)；PMR30各剂量组大鼠Oc.N下降(P<0.05)。与泼尼松组相比，PMRF高剂量组大鼠%Tb.A、BFR/TV上升(P<0.05)；PMRF各剂量组大鼠%Oc.S.Pm下降(P<0.05)。 (6)胫骨中段皮质骨二维形态计量学变化情况：与基础组相比，空白对照组大鼠皮质骨面积(Ct.Ar)增加(P<0.05)。与空白对照组相比，泼尼松组 Ct.Ar、皮质骨面积百分数(%Ct.Ar)、骨外膜矿化沉积率(P-MAR)降低(P<0.05)，骨髓腔面积百分数(%Ma.Ar)、骨内膜骨形成率(E-BFR/BS)上升(P<0.05)。与泼尼松组相比，罗盖全组、PMR30与 PMRF各剂量组%Ct.Ar、骨外膜荧光周长百分数(%P-L.Pm)有上升趋势，%Ma.Ar、E-BFR/BS有下降趋势(P>0.05)。 (7) HE染色结果：与基础组相比，空白对照组大鼠胫骨上段脂肪细胞数量稍微增加。与空白对照组相比，泼尼松组大鼠脂肪细胞数量较多且密集。与泼尼松组相比，罗盖全组、PMR30(中、低)及PMRF(高、中)剂量组大鼠脂肪细胞数量较少。 (8) Western blotting结果：与空白对照组相比，泼尼松组大鼠DKK1、WIF1蛋白表达量增加(P<0.05)。与泼尼松组相比，罗盖全组、PMR30(中、低)及PMRF高剂量组大鼠DKK1蛋白表达量下降(P<0.05)。与泼尼松组相比，PMR30中及PMRF高剂量组大鼠WIF1蛋白表达量下降(P<0.05)。 【结论】 1. PMR30中二苯乙烯苷与结合蒽醌含量分别为9.20%和0.15%，PMRF中二苯乙烯苷与结合蒽醌含量分别为2.23%和0.03%。 2. PMR30(中、低)剂量及PMRF高剂量对泼尼松致雌性大鼠骨丢失可能有预防作用。 3.何首乌抗糖皮质激素性骨质疏松的机制可能与激活Wnt信号通路有关，从而调控成骨细胞分化功能，发挥抗骨质疏松作用。

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英文摘要

1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 何首乌抗骨质疏松活性成分的富集及其工艺优化研究

2.1研究目的

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

3 何首乌提取物对泼尼松致大鼠骨质疏松的预防作用

3.1研究目的

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

4 讨论

4.1 何首乌提取物主要成分的检测

4.2 与基础年龄组（6 月龄）相比，空白对照组（11 月龄）雌性大鼠总体骨量增加，但骨形成活性减弱

4.3长期使用糖皮质激素对雌性大鼠骨代谢相关指标的影响

4.4 阳性对照药罗盖全对泼尼松所致的雌性大鼠骨丢失的预防作用

4.5 PMR30对泼尼松所致的雌性大鼠骨丢失的预防作用

4.6 PMRF对泼尼松致雌性大鼠骨丢失的预防作用

4.7 何首乌提取物对泼尼松大鼠骨代谢作用机制探讨

4.8 结语与展望

5. 结论

参考文献

综述: 防治糖皮质激素性骨质疏松的研究进展

致谢

附录一：缩 略 语 中 英 文 对 照

附录二 在读硕士期间的科研情况