香叶木素通过激活p53/Bcl-2以及抑制Notch3/NF-κB通路诱导HepG2细胞凋亡

摘要

【目的】 1.阐明香叶木素通过Notch3诱导HepG2细胞凋亡的机制。 2.探究Notch3信号通路在肝癌细胞凋亡中的调控机制。 3.论述Notch3与p53以及NF-κB之间串话调控机制。 【方法】 将HepG2细胞用含10%胎牛血清RPMI-1640培养液在37℃、5%二氧化碳及饱和湿度的细胞培养箱中培养。1～２天传代，融合度为50%～70%时用于实验操作。MTT实验检测香叶木素的细胞毒性，并得出香叶木素对 HepG2细胞的半数抑制率浓度。用不同浓度的香叶木素(0，5和10μg/ mL)分别处理HepG2细胞，24 h后收集细胞用于形态学观察拍照、流式细胞术等试验，检测HepG2细胞的凋亡情况，进行免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白（p53，PARP，Bcl-2，BAX，Notch3，cleaved-Notch3，NF-κB，IKKα/β）的变化趋势。进行免疫荧光实验检测p53和Notch3的蛋白表达水平变化趋势，将包装好的Notch3-siRNA转染HepG2细胞，建立Notch3低表达的稳定细胞系，用不同浓度香叶木素分别处理HepG2细胞组，对照组，Notch3低表达组，收集蛋白后检测Notch3敲低后相关蛋白变化趋势。用质粒包装p53shRNA转染HepG2细胞，检测p53低表达对Notch3，NF-κB，cleaved-Notch3蛋白表达水平的影响。平板克隆实验检测Notch3敲低对香叶木素抑制克隆形成的影响。 【结果】 1.香叶木素诱导 HepG2细胞凋亡并能够抑制细胞的增殖，数据表明，其作用效果与药物作用浓度和时间成正比。在光学显微镜下（200X），随着香叶木素浓度以及作用时间的增加，正常细胞明显减少，死亡细胞明显增多。MTT实验数据显示，香叶木素的细胞毒性随着浓度的增加而增加，香叶木素对HepG2细胞24 h的半数抑制率浓度（IC50）是25μg/ mL。 2.香叶木素通过激活 p53信号通路诱导 HepG2细胞凋亡。用 AnnexinV-FITC/PI双染色分析法检测不同浓度香叶木素处理HepG2细胞24 h后的凋亡实验表明香叶木素诱导HepG2细胞凋亡效果显著。通过免疫印迹实验我们发现，p53和 p53下游靶蛋白表达水平都明显上调，另外一个抗凋亡蛋白 Bcl-2明显下降。p53特异抗体进行免疫荧光染色进一步确认香叶木素处理HepG2细胞24 h后p53蛋白水平会上调。 3.香叶木素抑制Notch3和NF-κB信号通路。通过免疫印迹方法检测Notch3和cleaved-Notch3蛋白水平，发现Notch3，cleaved-Notch3和NF-κB在香叶木素处理后表达水平会相应降低。通过免疫荧光染色进一步确认香叶木素处理HepG2细胞24 h后Notch3蛋白表达水平会降低。 4.香叶木素干扰Notch3和p53蛋白水平的平衡引起NF-κB信号通路的抑制。Notch3基因的缺失会抑制p53的表达，但是敲低p53会上调Notch3受体含量并且增加cleaved-Notch3受体的释放。实验结果表明p53负性调节Notch3信号通路，但是Notch3的表达升高能够促进 p53的表达。此外，Notch3表达量的减少引起NF-κB和p53表达水平进一步降低，敲低p53能够上调Notch3受体表达水平和cleaved-Notch3的释放水平，抑制 NF-κB的表达。抑制Notch3能够增加香叶木素破坏HepG2细胞克隆增殖的能力。Notch3敲低能够减弱香叶木素处理引起的p53上调，Notch3的缺失会使香叶木素暴露引起NF-κB的下降更明显。香叶木素处理会引起HepG2细胞的凋亡蛋白BAX和PARP的表达水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下降。 【结论】 香叶木素能够诱导HepG2凋亡，并且具有浓度和时间依赖性。香叶木素通过激活 p53介导的细胞凋亡通路抑制细胞的生存力促进细胞凋亡。Notch3和NF-κB在细胞凋亡过程中也起着重要的作用。我们也发现香叶木素能够通过抑制Notch3受体表达来抑制IKKα/β，从而减少NF-κB信号的表达。Notch3和p53之间存在负反馈调节。P53，Notch3和NF-κB之间的串话机制仍需要进一步探究。我们认为香叶木素在治疗原发性肝癌中是一种非常有前景的天然药物。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 研究背景

1.2 研究目的

1.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要研究方法

3 结果

3.1 香叶木素诱导HepG2细胞凋亡并能够抑制细胞的增殖

3.2 香叶木素通过激活p53信号通路诱导HepG2细胞凋亡

3.3 香叶木素抑制Notch3 和NF-κB 信号通路

3.4 香叶木素干扰 Notch3 和 p53 蛋白水平的平衡引起 NF-κB信号通路的抑制

4 讨论

5 小结

参考文献

综述:Notch3在肿瘤发生发展中的作用

致谢

附录一 缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况