FKBP12/12.6对心脏结构和功能调控机制的研究

摘要

背景和目的：心力衰竭是指心肌的舒缩功能障碍而导致泵血能力降低。钙离子在心肌细胞的功能与代谢活动中发挥着关键性的调节作用，细胞内游离钙浓度紊乱不但是外界刺激所致心肌肥大发生发展的中心环节，而且是心肌兴奋收缩(Excitationcontraction，EC)偶联异常的核心。FK506结合蛋白(FK506bindingproteins，FKBPs)是一类能与大环内酯类免疫抑制剂FK506和雷帕霉素(Rapamycin，RAP)特异性结合的受体类蛋白家族，研究表明FKBP12/12.6是肌浆网钙释放通道——雷尼丁受体(Ryanodinereceptors，RyRs)的辅助蛋白，可以稳定RyRs通道处于关闭状态，与心肌EC偶联有关，且FKBP12/12.6参与心脏发育，对心肌细胞表型分化、心脏结构形成和心脏搏动的启动发挥重要的调节作用。 心力衰竭发生的病理生理机制是心肌重塑，心肌重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌结构、功能和表型的变化，这些变化包括：心肌细胞肥大、凋亡，胚胎基因和蛋白的再表达，心肌细胞外基质组成和量的变化，其中心肌细胞的肥大和凋亡均为心肌重塑的特征性改变。在众多参与心肌肥大的细胞内信号通路中，钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)和丝裂素活化蛋白激酶(Mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)通路起着关键作用。Bax/bcl-2是细胞凋亡的相关调控基因，bcl-2具有促进细胞生存，抗细胞凋亡的作用，bax作用与bcl-2相反，能诱导细胞凋亡。 那么，FKBP12/12.6调节心脏结构和功能的机制是什么呢?FKBP12/12.6对心肌细胞生长和钙信号的影响及相关的分子机制是什么呢?本课题以临床心肌组织标本和培养的乳鼠心肌细胞为模型，从组织到细胞再到分子水平，分三部分进行研究：检测心衰和先心病患者心肌组织FKBP12/12.6和RyR2表达，初步了解FKBP12/12.6与人类心脏疾病的关系；利用重组腺病毒技术，观察乳鼠心肌细胞过度表达或抑制FKBP12/12.6后对心肌细胞生长的影响，研究肥大信号CaN和细胞外信号调节激酶(Extracellularsignal-regulatedkinase，ERK1/2)以及凋亡信号bax/bcl-2的改变；探讨FKBP12/12.6对心肌细胞钙通道的影响及可能机制，为阐明心脏结构发育的机制和寻找心衰的防治新途径提供实验依据。 方法：(一)临床研究：收集我校新桥医院心外科住院，因瓣膜性心脏病接受瓣膜置换术的心功能不全病人11例，男1例，女10例；先天性心脏病接受手术治疗病人24例，男14例，女10例。Westernblot及RT-PCR检测各级心功能不全和不同类型先心病患者心肌组织FKBP12/12.6和RyR2蛋白和mRNA表达。(二)实验研究：重组腺病毒技术构建野生型和突变型FKBP12.6与野生型FKBP12病毒载体，并感染培养的乳鼠心肌细胞，用RAP和FK506药物干预观察以下指标：1.MoticImageAdvanced3.0图像分析系统测量心肌细胞的直径和面积；2.RT-PCR检测心肌细胞肌球蛋白重链(β-MHC)的表达；3.Westemblot方法检测肥大信号分子CaN和ERK1/2表达，凋亡信号分子bax和bcl-2蛋白水平，以及钙通道RyR2和瞬时受体电位通道(Transientreceptorpotentialchannel，TRPC3)蛋白表达水平；4.琼脂糖凝胶电泳检测心肌细胞DNA片段化；5.比率荧光成像系统观察心肌细胞静息游离钙水平和在雷尼丁(Ryanodine，RY)刺激下胞内游离钙的瞬时升高幅度和平台期波动幅度。 结论：通过观察心功能不全和先心病患者心肌组织FKBP12/12.6和RyR2表达，以及乳鼠心肌细胞过度表达或抑制FKBP12/12.6后对心肌细胞生长、钙信号以及相关信号通路的影响，得出以下结论： 1.心功能不全和先心病患者心肌组织FKBP12/12.6表达有改变，提示FKBP12/12.6参与心脏发育与维持正常心功能，FKBP12/12.6可能是心脏结构发育的易感基因。 2.过度表达野生型FKBP12.6可引起心肌细胞肥大，而突变型FKBP12.6和野生型FKBP12可抑制心肌细胞生长，这与CaN和ERK1/2信号激活或抑制有关。过度表达野生型和突变型FKBP12.6、野生型FKBP12均可诱导bax和bcl-2表达引起心肌细胞凋亡。RAP和FK506通过下调肥大信号CaN和ERK1/2，以及凋亡信号bax和bcl-2抑制心肌重塑。 3.通过调节RyR2和TRPC3通道蛋白表达，FKBP12.6过度表达后心肌细胞静息状态下的胞内游离钙浓度以及RY刺激下细胞内游离钙瞬时升高幅度和平台期波动幅度均有增加趋势，而过度表达突变型FKBP12.6和野生型FKBP12后心肌细胞内钙反应性减低。

目录

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英文缩写—览表

前 言

第一部分FKBP12/12.6在心功能不全和先天性心脏病中的变化

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分FKBP12/12.6对心肌细胞生长及相关信号通路的影响

分题一 重组腺病毒Ad-FKBP12/12.6的构建

材料与方法

结 果

讨 论

分题二　FKBP12/12.6介导的心肌细胞生长及相关信号通路

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第三部分FKBP12/12.6对心肌细胞钙调控通道的作用

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文总结

致 谢

图 片1

图 片2

图 片3

参考文献

文献综述：FK506结合蛋白对Ryanodine受体的调节作用

博士在读期间撰写的论文