sAA糖基化和总含量测定方法及其含量与活性关系的研究

摘要

目的:脾虚症唾液淀粉酶(sAA)酸刺激后/前活性比值较正常人低,作为中医脾虚证的辩证诊断参考指标被用于中医基础和临床研究,然而,脾虚症唾液淀粉酶活性改变的机制尚未研究清楚,本文主要从影响sAA活性的sAA含量和糖基化水平进行研究,建立WB测定sAA糖基化和总量的方法并对sAA活性与sAA糖基化及总量的相关性进行分析,以期为中医脾虚证酸刺激前后sAA活性改变机制中蛋白表达方向相关研究提供方法学参考。
　　方法:1、规范柠檬酸刺激采集唾液的方法;
　　2、采集柠檬酸刺激前后健康成人、儿童和脾虚儿童的唾液样本,检测唾液pH、唾液流率,主要通过EPS-G7速率法测定sAA活性,BCA蛋白试剂盒检测唾液总蛋白浓度,Western Blot测定sAA总量和糖基化sAA含量,计算比活,对sAA活性与sAA总量和糖基化含量相关性分析。
　　结果:㈠采用0.4mol/L1×1cm柠檬酸滤纸刺激下,唾液流率(刺激时:1.4944±0.5692mL/min;刺激后:0.8528±0.4047mL/min)和sAA活性比值(刺激时:1.5571±0.4585;刺激后:1.7246±0.4527)增加最为明显(P<0.05);
　　㈡测定sAA活性时,EPS-G7速率法,变异系数(CV)基本控制在5％以下,而碘-淀粉比色法的CV都在10%以上,并且有一半在30-48%;
　　㈢Western Blot技术DAB显色方法得到糖基化sAA含量占总sAA20%-30%;
　　㈣健康成人和儿童酸刺激后,唾液pH、唾液流出率、sAA活性、sAA浓度、糖基化sAA浓度、比活都增加,其中儿童增加更为明显(P<0.05)。这些指标酸刺激后与酸刺激前比值,成人比儿童的小。另外,成人酸刺激前、后sAA活性都比儿童的高。酸刺激后,成人唾液总蛋白浓度显著降低(P<0.05),而儿童则有增加的趋势。
　　㈤脾虚儿童酸刺激后,唾液pH、唾液流出率、sAA活性、sAA浓度、糖基化sAA浓度、比活都增加,但这些指标酸刺激后与酸刺激前比值,除唾液总蛋白浓度和sAA浓度变化不明显外,脾虚儿童都小于健康儿童。另外,脾虚儿童酸激刺前sAA活性、唾液总蛋白浓度、sAA和糖基化sAA浓度和比活均大于健康儿童酸刺激前相应值。
　　㈥健康成人、脾虚儿童的sAA活性与sAA和糖基化sAA浓度的相关性和健康儿童sAA活性与糖基化sAA浓度的相关性均为酸刺激后大于酸刺激前,健康成人sAA活性与sAA浓度的相关性为酸刺激后小于酸刺激前,其中健康儿童:酸碱前sAA活性与sAA浓度相关性较高(R=0.697),酸刺激后sAA活性与糖基化sAA浓度的相关性较高(R=0.503)。
　　结论:⑴成功规范了柠檬酸滤纸刺激采集唾液的方法即选择0.4mol/L1×1cm柠檬酸滤纸刺激1min,收集刺激后2min全唾液;确立了测定sAA活性更稳定的EPS-G7速率法;成功建立了Western Blot测定sAA含量及糖基化含量的方法,为sAA活性改变机制的研究提供了方法学的参考。
　　⑵脾虚儿童酸刺激前sAA活性大于健康儿童,酸刺激后/前的sAA活性比值比健康儿童低,与临床脾虚证辩证理论一致,进一步证明了实验方法的准确可靠。
　　⑶酸刺激前后sAA活性与含量的相关性存在差异,且均呈现明显的正相关。sAA含量和糖基化水平都是影响其活性的因素。

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第一章 前言

1.1 唾液及唾液淀粉酶（sAA）的简介

1.2 唾液及sAA的分泌机制

1.3 唾液及sAA临床研究意义

1.4 sAA的度量单位

1.5 影响sAA活性的因素

1.6 sAA相关研究方法

第二章 研究目的内容及意义

2.1 研究意义

2.2 研究内容

2.3 研究方法

2.4 技术路线

第三章 实验研究内容

第一节 柠檬酸酸刺激前后唾液采集方法的规范

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

第二节 sAA活性检测方法EPS-G7速率法的确立

2.1 实验材料

2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第三节 Western Blot检测sAA含量及DAB显色方法的建立

3.1 实验材料

3.2 实验方法及流程

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四节 健康成人酸刺激前后唾液和sAA的研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与分析

4.4讨论

第五节 脾虚和健康儿童酸刺激前后唾液和sAA的研究

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果

5.4 讨论

结语

参考文献

已发表论文

附录

致谢