下牙槽神经缺失对下颌骨骨缺损骨痂血肿期炎症因子表达影响的实验研究

摘要

在骨缺损愈合过程中,神经系统一直参与调控骨痂的纤维化、软骨形成、骨矿化改建等过程,尤其是通过周围神经末梢分泌的神经肽与局部其他细胞因子共同作用于局部骨痂组织,影响成骨细胞和破骨细胞的分化和功能,完成对新骨形成和改建的调控作用[1-2]。近年来的研究证实,降钙素基因相关肽(Calcitoningene-relatedpeptideCGRP)是周围神经分泌的神经肽之一,在新骨形成改建过程中发挥着重要作用[3]。本课题组前期研究证实,下牙槽神经(InferioralveolarnerveIAN)能够通过CGRP调控NO/NOi、OPG/RANKL等细胞信号通路,影响局部骨痂改建、新骨形成,从而影响下颌骨骨缺损的愈合[4-5]。
　　炎症是机体对损伤因子的一种病理性防御反应,在局部骨缺损处的血肿形成新骨的过程中,炎症因子始终以自分泌和旁分泌的形式,参与控制骨痂的改建[6]。下牙槽神经缺失是否影响早期神经肽CGRP分泌?CGRP表达变化是否影响骨痂血肿期炎症因子的表达变化?国内外还鲜有报道,本研究通过建立失IAN和保留IAN兔下颌骨骨缺损动物模型[7],探讨CGRP对骨缺损骨痂血肿期炎症因子的影响,进一步探讨周围感觉神经调控骨缺损愈合的可能机制,并检测下颌骨骨缺损血肿周围局部骨组织中,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)及其mRNA表达和神经肽CGRP的表达,探讨周围神经系统对下颌骨骨缺损愈合影响的可能机制。
　　方法:
　　1、实验动物及分组
　　成年中国大白兔50只,体重1.9kg~2.1kg,雌雄不限,由第三军医大学新桥医院实验动物中心提供。实验动物随机分为实验组和对照组,实验组为左下牙槽神经缺失并左下颌骨骨缺损;对照组为单纯左下颌骨骨缺损,实验时间点设为1d、2d、3d、5d、7d,在实验时间点快速处死实验动物,快速切取骨缺损区周围2mm骨组织,液氮保存待用。
　　2、ELISA法检测实验组和对照组不同实验时间点IL-1β、IL-6、TNF-α表达。
　　3、荧光realtime-PCR法检测实验组和对照组不同实验时间点IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达。
　　4、HE染色观察实验组和对照组不同实验时间点局部骨痂组织变化,免疫组化法检测实验组和对照组不同实验时间点局部骨痂周围骨组织CGRP表达。
　　结果:
　　1.ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α表达
　　1.1IL-1β表达:骨缺损后1d,实验组表达降低,与对照组相比具有非常显著差异(P<0.01);2d实验组明显低于对照组(P<0.05),表达有显著差异(P<0.05);5d时实验组表达高于对照组,相比有显著差异(P<0.05);3d、5d两组相比无明显差异。
　　1.2IL-6表达:骨缺损后1d,IL-6实验组表达降低,与对照组相比具有非常显著差异(P<0.01);骨缺损后2d,实验组表达低于对照组,两组相比有显著差异(P<0.05);3d、5d、7d两组之间无明显差异。
　　1.3TNF-α表达:骨缺损后1d,实验组表达低于对照组,两组之间具有非常显著差异(P<0.01);2d时两组之间无显著差异,实验组表达升高,对照组表达降低,而实验组与1d实验组相比,具有非常明显差异;3d实验组表达低于对照组,两组相比具有显著差异(P<0.05);5d实验组表达高于对照组,两组相比具有显著差异(P<0.05),7d时则无明显差异。
　　2.荧光realtime-PCR法检测IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达
　　2.1IL-1βmRNA表达:1d、2d、3d实验组与对照组相比,表达降低,具有非常显著差异(p<0.01);5d实验组高于对照组,两组相比表达具有显著差异(p<0.05);7d两组表达无明显差异。
　　2.2IL-6mRNA表达:1d、2d、3d、5d实验组表达低于对照组,具有非常显著差异(p<0.01);7d两组表达相比无明显差异;随时间延长两组表达呈现下降趋势。
　　2.3TNF-αmRNA表达:1d实验组表达低于对照组,具有非常显著差异(p<0.01);2d、5d两组相比表达具有显著差异(p<0.05);3d、7d两组相比表达无明显差异;二组随实验时间的延长,表达呈现下降趋势。
　　3.HE染色:1d,实验组和对照组骨缺损区充满血细胞,边缘可见大量炎性细胞出现;2d实验组骨缺损区边缘可见由纤维网架结构组织出现,较对照组少,其间散在大量的炎性细胞;3d骨缺损区边缘纤维组织进一步增宽,血细胞量减少,对照组内血细胞基本吸收完毕,由纤维组织代替;5d实验组骨缺损区纤维网架结构较对照组宽;7d实验组大量纤维组织增生,有少量编织骨形成,成熟度不高,中心位置还有少量纤维组织,对照组已完全由结缔组织代替,可见在成纤维细胞簇集的部位有少量的骨基质沉积,较多的编织骨形成。
　　4.免疫组化法检测CGRP(AOD)表达:1d、3d、7d实验组表达与对照组相比,具有显著差异(p<0.05);2d、5d两组相比具有非常显著差异(p<0.01);各实验时间点实验组表达钧低于对照组。
　　结论:
　　在下颌骨骨缺损骨痂血肿炎症期,下牙槽神经缺失致其分泌的神经肽CGRP表达减少,导致局部细胞炎症因子表达及其mRNA表达降低,使血肿期炎症反应降低,局部骨缺损间隙血肿形成纤维骨痂时间延长,对骨缺损组织正常愈合产生负向调控作用。

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第一章 前 言

第二章 下牙槽神经缺失对下颌骨骨缺损骨痂血肿期炎症因子表达影响的实验研究

2.1 实验一

2.1.1 材料和方法

2.1.2 结 果

2.2 实验二

2.2.1 材料和方法

2.2.2 结 果

2.2.3 讨 论

2.2.4 小结

第三章 下牙槽神经缺失对下颌骨骨缺损骨痂血肿期CGRP的表达及对骨缺损早期愈合影响的实验研究

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 CGRP表达免疫组化染色检测

3.1.3 数据的统计分析

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

研究生期间发表论文

致谢