P2Y12受体、P2X7受体介导小胶质细胞活化参与神经病理性疼痛的初步研究

摘要

神经病理性疼痛是各种因素导致的外周神经损伤引起的慢性疼痛,是一类严重困扰患者身心健康的临床顽症。作为机体接受痛、温、触觉初级感觉神经元的突触中枢端所在区域,脊髓背角在伤害性感受信息的传递和调制中,起到了十分重要的作用,也是最初始的位点,同时也是各类受体分子、神经递质以及神经活性物质含量最为丰富的部位。对于脊髓水平上疼痛信息传递、调制的研究,为神经病理性疼痛的发生和维持的研究,提供了重要的病理生理基础。过往的研究显示脊髓背角活化的小胶质细胞在神经病理性疼痛的发生和维持中发挥了重要作用,但对小胶质细胞活化的详细分子和细胞机制仍不甚清晰。
　　三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)及其水解产物二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)是一种重要的神经递质。P2嘌呤受体是ATP等嘌呤类物质的生理性受体,包括种离子通道型P2X受体和种G蛋白耦联P2Y受体。其中P2X7受体是P2X家族中一个独特的亚型,P2Y12受体是P2Y受体家族中的重要一员,二者均表达于小胶质细胞表面,在中枢神经系统内分布广泛。研究表明这两种受体可能都参与了痛觉信息的传递和调制。外周神经损伤后,损伤组织和感觉神经末梢均可释放大量的ATP,随后,ATP在水解酶的作用下水解为ADP,研究表明,ATP及ADP均可激活小胶质细胞,并促使其释放多种前炎因子和神经活性物质。但是P2X7、P2Y12受体如何参与小胶质细胞的活化,而后又如何参与神经病理性疼痛尚不清楚。
　　本项目以原代培养大鼠皮层小胶质细胞及大鼠坐骨神经结扎(Chronic Construction Injury,CCI)模型为研究对象,结合形态学、行为学和钙荧光成像等多种技术方法,观察P2Y12受体激活对小胶质细胞内游离Ca2+浓度(the intracellular concentration of Ca2+,[Ca2+]i)的影响,P2X7受体、P2Y12受体激活对IL-1β、TNF-α等炎性因子释放的影响,初步探讨P2X7受体、P2Y12受体激活对小胶质细胞活化的影响及其可能的调控机制;观察蛛网膜下腔给药对正常及CCI大鼠脊髓背角小胶质细胞活化的影响,为P2X7受体、P2Y12受体介导小胶质细胞活化,参与神经病理性疼痛提供实验基础。该研究对阐明神经病理性疼痛的机制具有重要意义。
　　方法:
　　原代培养小胶质细胞,使用免疫荧光标记技术观察原代培养的小胶质细胞表面P2Y12受体、P2X7受体和CD11b的表达;免疫组织化学染色观察2MeSADP、AR-C66096+2MeSADP、BzATP和BBG+BzATP分别作用于原代培养小胶质细胞后表面形态的改变;激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察2MeSADP、AR-C66096+2MeSADP作用下原代培养小胶质细胞[Ca2+]i变化;应用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)观察MeSADP、AR-C66096+2MeSADP、BzATP、BBG+BzATP等药物作用下原代培养小胶质细胞IL-1β、TNF-α两种炎性因子的释放;大鼠蛛网膜下腔分别给予2MeSADP、AR-C66096+2MeSADP、BzATP、BBG+BzATP,以及CCI术后大鼠鞘内给予AR-C66096、BBG,通过免疫组织荧光染色观察脊髓背角CD11b表达变化;Von Frey(vFh)纤维丝和热辐射法测痛检测大鼠机械痛阈和热痛阈的变化。
　　结果:
　　第二章:
　　1.原代培养的小胶质细胞,免疫荧光标记显示其CD11b阳性率>％,符合后续实验要求。免疫荧光双重标记染色表明小胶质细胞表达P2Y12受体蛋白,其阳性主要分布于小胶质细胞膜和胞浆内。
　　2.P2Y12受体激动剂,MeSADP作用于小胶质细胞可促进其[Ca2+]i升高,而在预孵育P2Y12特异性阻断剂AR-C660962min后,MeSADP诱发的小胶质细胞[Ca2+]i反应完全被抑制。
　　3.100μM2MeSADP刺激小胶质细胞hr后可以诱导小胶质细胞活化,引起小胶质细胞表面形态的改变,而预孵育AR-C66096可以抑制这一效应。
　　4.100μM2MeSADP作用于小胶质细胞hr后,培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度显著增加,而AR-C66096可以抑制这种作用。
　　5.移除细胞外Ca2+后,μM2MeSADP刺激小胶质细胞hr后,其培养液IL-1β浓度与未移除细胞外Ca2+相比较有所降低。预孵育μMG蛋白解偶联剂GDPβS、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)拮抗剂新霉素后,再加入MeSADP,其培养液IL-1β浓度与未孵育GDPβS、新霉素时相比有所下降。预先孵育μM蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89后再加入MeSADP,培养液中IL-1β浓度与未孵育H-89时未见明显变化。
　　6.移除细胞培养基中的Ca2+后,μM2MeSADP作用于小胶质细胞hr后,其培养液中TNF-α与未移除细胞外Ca2+相比明显下降。预孵育100μM G蛋白解偶联剂GDPβS、PLC拮抗剂新霉素、PKA阻断剂H-89以及p38MAPK通路阻断剂SB203580后,培养液上清中TNF-α与未孵育GDPβS、新霉素、H-89、SB203580时相比有所降低。而预先加入μM蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)阻断剂Che后,再加入MeSADP(终浓度μM),其培养基上清中TNF-α浓度与未孵育Che时没有明显变化。
　　第三章:
　　1.原代培养小胶质细胞,免疫荧光双重标记表明小胶质细胞表达P2X7受体蛋白,其阳性主要分布于小胶质细胞膜和胞浆内。
　　2.100μM BzATP作用小胶质细胞hr后可以诱导小胶质细胞活化,引起小胶质细胞表面形态的改变,而预孵育BBG可以抑制这一效应。
　　3.100μM BzATP作用于小胶质细胞hr后,培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度显著增加。而BBG可阻断此作用。
　　4.在缺乏细胞外Ca2+的环境中,100μM BzATP作用于小胶质细胞hr后,其培养液中IL-1β浓度与未移除细胞外Ca2+相比明显降低。预孵育100μM G蛋白解偶联剂GDPβS、PLC拮抗剂新霉素后,再加入后再加入BzATP,其培养液IL-1β浓度与未孵育GDPβS、新霉素时相比未见明显改变。而预孵育μM PKA阻断剂H-89后再加入BzATP,其培养液IL-1β浓度与未孵育H-89时则出现显著下降。
　　5.移除细胞培养基中的Ca2+后,μM BzATP作用于小胶质细胞hr后,其培养液中TNF-α与未移除细胞外Ca2+相比明显下降。预孵育100μM G蛋白解偶联剂GDPβS、PLC拮抗剂新霉素以及p38MAPK通路阻断剂SB203580后,培养液上清中TNF-α与未孵育GDPβS、新霉素、SB203580时相比未见明显改变。而预孵育μM PKA抑制剂H-89、PKC阻断剂Che后,再加入BzATP(终浓度μM),其培养基上清中TNF-α浓度与未孵育Che时出现明显下降。
　　第四章:
　　1.每日鞘内给予P2Y12受体激动剂MeSADP,从给药d开始,大鼠下肢痛阈开始出现明显降低,并伴有相关痛行为;至给药第d达到最低值,停止给药后,痛阈曲线逐渐恢复至正常水平。在同时给予P2Y12受体拮抗剂AR-C66096+2MeSADP或单独给予P2Y12受体拮抗剂AR-C66096或PBS时,均未见大鼠痛阈出现明显改变。而在CCI模型大鼠鞘内给予AR-C66096后,则可以观察到大鼠痛阈下降趋势明显缓解并且与同时间CCI大鼠痛阈相比有明显提升,提示AR-C66096可以通过抑制P2Y12受体缓解CCI大鼠疼痛。
　　2.给予P2Y12受体激动剂MeSADP的大鼠,L4~6段脊髓背角浅层CD11b阳性细胞数及光密度值均高于PBS对照组,且给药d组,明显高于其他组别。CCI-14d大鼠脊髓背角小胶质细胞明显活化,CD11b阳性细胞数及平均光密度均高于对照组,CCI+AR-C66096组大鼠脊髓背角CD11b平均光密度与手术组相比显著降低。
　　3.每日鞘内给予P2X7受体激动剂BzATP,从给药第d开始,大鼠出现明显的痛相关行为,检测痛阈发现大鼠下肢痛阈开始显著下降;至给药第d达到最低值,停止给药后,痛阈曲线逐渐恢复至正常水平。在同时给予P2X7受体拮抗剂BBG+BzATP或单独给予P2X7受体拮抗剂BBG或PBS时,均未见大鼠痛阈出现明显改变。在CCI模型大鼠鞘内给予BBG后,可以观察到大鼠痛阈下降趋势明显缓解,与同时间CCI大鼠痛阈相比有明显提升,提示BBG可以通过抑制P2X7受体缓解CCI大鼠疼痛。
　　4.给予P2X7受体激动剂BzATP的大鼠,L4~6段脊髓背角浅层CD11b阳性细胞数及光密度值均高于PBS对照组,且给药d组,明显高于其他组别。CCI-14d大鼠脊髓背角小胶质细胞显著活化,CD11b阳性细胞数及平均光密度均高于对照组,而CCI+BBG组大鼠脊髓背角CD11b平均光密度与手术组相比明显降低。
　　结论:
　　1.P2Y12受体、P2X7受体均表达于原代培养的小胶质细胞表面,参与介导原代小胶质细胞的活化;MeSADP激活P2Y12受体后诱发小胶质细胞[Ca2+]i升高;
　　2.2MeSADP可促进小胶质细胞释放IL-1β、TNF-α,这一效应是由P2Y12受体参与介导,受到细胞外Ca2+浓度影响,还受到PLC的调控,而不受PKC的影响;
　　3.BzATP可促进小胶质细胞释放IL-1β、TNF-α,这一效应是由P2X7受体参与介导,受到PKA调控,并受细胞外Ca2+浓度影响,而不受G蛋白和PLC的影响;
　　4.鞘内给予P2Y12受体激动剂或P2X7受体激动剂,大鼠热痛阈和机械痛阈均明显降低;脊髓背角CD11b表达显著增加;
　　5.CCI大鼠鞘内给予P2Y12受体抑制剂或P2X7受体抑制剂可以明显缓解疼痛行为,并提高CCI手术导致的痛阈降低,同时抑制CCI大鼠脊髓背角CD11b细胞的增多,减少小胶质细胞的活化。
　　综上所述,脊髓背角小胶质细胞特异性表达的P2Y12受体和P2X7受体,可以介导小胶质细胞活化,并通过促进其释放IL-1β、TNF-α这两种促炎因子,参与启动神经病理性疼痛的发生过程、并促进其发展。因此,脊髓背角水平上小胶质细胞表面的这两种受体可能是未来治疗神经病理性疼痛药物研发新的位点。

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第一章 前 言

第二章 P2Y12受体介导小胶质细胞活化、促进炎性介质释放

2.1 P2Y12受体介导小胶质细胞活化

2.2 P2Y12受体激活促进小胶质细胞IL-1β的释放

2.3 P2Y12受体激活促进小胶质细胞TNF-α的释放

2.4 讨论

第三章 P2X7受体介导小胶质细胞活化、促进炎性介质释放

3.1 P2X7受体介导小胶质细胞活化

3.2 P2X7受体激活促进小胶质细胞IL-1β的释放

3.3 P2X7受体激活促进小胶质细胞TNF-α的释放

3.4 讨论

第四章 P2Y12受体、P2X7受体介导小胶质细胞活化参与神经病理性疼痛

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 小结

4.4 讨论

参考文献

致谢